BlimP-1在小鼠骨髓移植后GVHD中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討B(tài)淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白(Blimp-1)在小鼠異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)后并發(fā)癥移植物抗宿主病(GVHD)中的作用;并通過GST-blimp-1融合蛋白的原核表達(dá)，在蛋白質(zhì)水平上研究Blimp-1調(diào)控移植后GVHD的深層機(jī)制。
　　方法：1.根據(jù)孟德爾交換和自由組合律以及cre-loxp基因敲除系統(tǒng)原理，將B6.Blimp-1flox/flox小鼠和B6.Lck-Cre小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)、繁殖并交配產(chǎn)生基因型為

2、B6.Blimp-1flox/+Cre小鼠，然后子代小鼠雜交，產(chǎn)生子二代小鼠，并剪取其鼠尾末端約0.3cm，抽提基因組DNA，采用PCR對(duì)子二代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，挑選出基因型為B6.Blimp-1flox/floxCre的T細(xì)胞特異性敲除Blimp-1小鼠，并通過磁珠分選技術(shù)從Blimp-1基因敲除小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞中分選出T細(xì)胞和B細(xì)胞，裂解細(xì)胞并采用Westem blot技術(shù)鑒定兩種細(xì)胞中Blimp-1蛋白的表達(dá)。2.以B6.Bli

3、mp-1flox/faoxCre小鼠、B6.Blimp-1flox/+Cre的小鼠和B6小鼠為供鼠，以BALB/c小鼠為受鼠，行異基因造血干細(xì)胞移植，觀察移植后小鼠生活狀態(tài)、體重變化并記錄不同實(shí)驗(yàn)組小鼠生存率，于移植后45天獲取小鼠外周血和脾細(xì)胞懸液，通過胞內(nèi)染色及CBA技術(shù)檢測不同實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)外周血及脾中效應(yīng)T細(xì)胞和初始T細(xì)胞亞群、Th細(xì)胞亞群及各種細(xì)胞因子的變化，并對(duì)小鼠肝臟、肺臟、小腸、皮膚等臟器進(jìn)行病理學(xué)檢測，參照Blazar

4、和Kaplan等急性GVHD病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組GVHD發(fā)生情況進(jìn)行綜合評(píng)分。3.利用RT-PCR擴(kuò)增小鼠Blimp-1基因，并將其克隆至pCR-blunt載體中;酶切制備Blimp-1基因片段，插入表達(dá)載體pGEX-4T-1，生成重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Blimp-1，轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞以ITPG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。裂解細(xì)菌，Western Blot和SDS-PAGE電泳檢測GST-Blimp-1融合蛋白的表達(dá)。
　

5、　結(jié)果：1.從轉(zhuǎn)基因小鼠B6.Blimp-1flox/flox和B6.Lck-Cre雜交子二代小鼠中成功篩選出基因型為B6.Blimp-1flox/floxCre的小鼠，并通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)該基因型小鼠Blimp-1蛋白僅表達(dá)于B細(xì)胞，而并不表達(dá)于T細(xì)胞，故成功篩選出T細(xì)胞特異性敲除Blimp-1的小鼠。2.Allo-HSCT后，供者T細(xì)胞完全敲除Blimp-1的小鼠生存率增加(P＜0.05)且GVHD的發(fā)生率及程度減

6、輕(P＜0.05)，而不完全敲除供者T細(xì)胞Blimp-1的小鼠與野生型小鼠相比無論生存率或GVHD的發(fā)病均無顯著差異（P＞0.05）。通過對(duì)小鼠血漿進(jìn)行CBA檢測顯示完全敲除供者T細(xì)胞Blimp-1的小鼠血清中IFN-γ、TNF和IL-10的分泌減少(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血和脾臟中Th細(xì)胞亞群，結(jié)果顯示，與其它移植組相比，供者T細(xì)胞完全敲除Blimp-1的小鼠外周血和脾臟Th1細(xì)胞的比例降低(P＜0.05)，而

7、Th2和Th17細(xì)胞比例增高（P＞0.05），而不完全敲除供者T細(xì)胞Blimp-1的小鼠與野生型小鼠相比各Th細(xì)胞亞群均無顯著差異（P＞0.05）。并且通過對(duì)小鼠各臟器組織行伊紅-蘇木素(HE)染色，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組小鼠GVHD靶器官，包括肝臟、肺臟及腸道均有不同程度的損傷，而以供者T細(xì)胞完全敲除Blimp-1的小鼠損傷程度減輕，而不完全敲除供者T細(xì)胞Blimp-1的小鼠與野生型小鼠臟器損傷較重，且后兩者臟器損傷并無顯著差異（P＞0.05）

8、。3.經(jīng)酶切鑒定及測序結(jié)果證實(shí)，構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-1-Blimp-1，并且轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集細(xì)胞，通過SDS-PAGE電泳和Western Blot在BL21細(xì)菌中檢測到了GST-Blimp-1融合蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：1、在小鼠allo-HSCT后GVHD中，敲除供者T細(xì)胞Blimp-1可減輕移植后小鼠GVHD的發(fā)病及其嚴(yán)重程度。2、在小鼠GVHD中，敲除供者T細(xì)胞Bl