iPS細(xì)胞來源的嵌合體胸腺移植對異基因骨髓移植小鼠的T細(xì)胞重建和GVHD的影響.pdf

1、加快異基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation，allo-BMT)后T細(xì)胞重建能夠降低感染和腫瘤復(fù)發(fā)的幾率。胸腺移植(thymus transplantation，TT)作為一種提高胸腺功能、加快T細(xì)胞重建的方法，已被臨床用于治療DiGeorge綜合征、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病、艾滋病等疾病。前期研究顯示，TT聯(lián)合allo-BMT不但能夠促進(jìn)T細(xì)胞重建，加強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，而且不會引起嚴(yán)重的移植物

2、抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。然而胸腺供體來源缺乏制約了TT在allo-BMT的應(yīng)用。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPScells)具有和胚胎干細(xì)胞相似的功能，學(xué)者們已成功將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為造血祖細(xì)胞、神經(jīng)元、胰島β細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。iPS細(xì)胞技術(shù)為培養(yǎng)人工胸腺提供了新思路。目前國內(nèi)外尚未有將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胸腺并運(yùn)用于異基

3、因骨髓移植的研究報道。
　　研究目的:
　　本課題組前期研究將表達(dá)綠色熒光蛋白的C57BL/6小鼠的iPS細(xì)胞，通過顯微注射到ICR小鼠囊胚腔內(nèi)，獲得的嵌合胚胎移植到代孕雌性ICR小鼠子宮內(nèi)，最終獲得嵌合子代，用iPS細(xì)胞成功構(gòu)建了嵌合體胸腺。本研究首次將嵌合體胸腺用于allo-BMT時的TT，探索其對受體T細(xì)胞重建和GVHD的影響。旨在解決TT的來源，并尋找一種加快allo-BMT后T細(xì)胞重建的新方法。
　　研究方法

4、:
　　1.異基因骨髓內(nèi)骨髓移植、胸腺移植和淋巴細(xì)胞輸注異基因骨髓內(nèi)骨髓移植（intra-bone marrow-bone marrow transplantation,IBM-BMT）:受體BALB/c小鼠移植前24h均接受X射線全身照射。取C57BL/6小鼠的股骨和脛骨的骨髓細(xì)胞(bone marrow cells，BMCs)，制成單細(xì)胞懸液。將受體小鼠麻醉，使用微量注射器穿過關(guān)節(jié)囊將BMC1×107/mouse注入脛骨骨髓腔

5、內(nèi)。TT:取嵌合體小鼠胸腺，分離為大小約2×2×1mm的組織塊，暴露受體左側(cè)腎臟于體腔外，將胸腺組織塊置于腎被膜下，逐層縫合肌肉及皮膚。淋巴細(xì)胞輸注(donorlymphocyte infusion，DLI):取C57BL/6小鼠的脾臟，研磨，計數(shù)，通過鼠尾靜脈注入5×106/mouse脾臟單細(xì)胞懸液。
　　2.IBM-BMT+TT組的供體胸腺和各組GVHD的觀察
　　實(shí)驗(yàn)分三組:IBM-BMT組，IBM-BMT+TT組，I

6、BM-BMT+DLI組。移植4周后，取移植的供體胸腺行HE染色，觀察組織學(xué)形態(tài)。每周測量小鼠體重2-3次，同時觀察GVHD的表現(xiàn)。取受體小鼠的肝臟、小腸、皮膚，10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察其GVHD的病理變化。
　　3.檢測各組T細(xì)胞亞群
　　在移植4周后，取受體小鼠外周血，流式細(xì)胞儀分析檢查植入狀態(tài)、分析不同實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞亞群比例。取脾臟，流式細(xì)胞儀分析不同組Foxp3+CD4+T細(xì)胞的比例。
　

7、　研究結(jié)果:
　　1.IBM-BMT+TT組、IBM-BMT+DLI組、IBM-BMT組外周血CD8+T細(xì)胞組比例分別為（11.10±1.49）％，（8.49±0.82）％，（5.52±0.83）％，兩兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。IBM-BMT+TT組的外周血CD4+T細(xì)胞比例為（9.60±0.69）％，顯著高于IBM-BMT+DLI組的(8.07±0.65)％及IBM-BMT組(6.42±1.40)％(P＜0.05)

8、。
　　2.IBM-BMT+TT、IBM-BMT組的脾臟Foxp3+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例分別為（1.86±0.36）％、（2.29±0.23）％，顯著高于IBM-BMT+DLI組（0.07±0.05）％(P＜0.05)。
　　3.IBM-BMT+TT、IBM-BMT組的GVHD臨床評分低于IBM-BMT+DLI組，病理學(xué)檢查GVHD表現(xiàn)更輕。
　　研究結(jié)論:
　　1.iPS細(xì)胞來源的嵌合體胸腺移植，通過胸腺依