PPARs篩選模型的構(gòu)建及抗糖尿病天然藥物活性成分的篩選.pdf

1、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）與糖尿病等代謝疾病在內(nèi)的慢性疾病密切相關(guān)。現(xiàn)有的PPARs激動劑包括天然激動劑和合成激動劑。由于人工合成的激動劑，尤其是單靶點(diǎn)的PPARγ配體藥物，不斷顯現(xiàn)出嚴(yán)重的毒副作用，現(xiàn)急需尋找低毒、高效的PPARs泛激動劑。而天然藥物尤其是中藥，多年來都發(fā)揮著治療和預(yù)防疾病的重要作用，且具有可長期服用的特點(diǎn)，使得從天然藥

2、物中篩選新型的PPARs泛激動劑，成為開發(fā)治療糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥藥物的研究熱點(diǎn)。
　　本研究以PPARα, PPARβ和PPARγ作為靶點(diǎn)，首次從12種具有治療糖尿病作用的天然藥物中，篩選出了PPARs活性部位及成分，是對其藥物作用機(jī)理的補(bǔ)充和闡明，為這些天然藥物的現(xiàn)代化發(fā)展，及糖尿病新藥的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　首先，為能有效的從天然藥物中篩選出PPARs激動劑，在細(xì)胞水平上建立了以PPARα, PPARβ或PPARγ為靶

3、點(diǎn)的高通量篩選模型。將重組質(zhì)粒pBIND-PPAR（α、β或γ）-LBD與報(bào)告基因pGL4.35，共同轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞中，以PPARs的激動劑作為陽性對照（PPARα：非諾貝特；PPARβ：L165041；PPARγ：羅格列酮），通過測定熒光酶素的表達(dá)率，確定了PPARs篩選實(shí)驗(yàn)的條件。同時(shí)，首次引入Z′-因子對以 PPARα, PPARβ或 PPARγ為靶點(diǎn)的細(xì)胞模型進(jìn)行評價(jià)。證實(shí)本研究在HeLa細(xì)胞上，構(gòu)建了一種簡單、穩(wěn)定、有效的和

4、多靶點(diǎn)的高通量篩選模型，可用于篩選PPARs泛激動劑、雙激動劑或單激動劑。
　　接著，制備天然藥物的提取物。用不同極性的溶劑，正己烷、70％乙醇、乙酸乙酯和蒸餾水為溶劑，依次對12種具有治療糖尿病作用的天然藥物（川黃連、女貞子、豬牙皂、廣西山楂、石斛、桑葉、丹參、澤瀉、林檎葉、綠蘿花、翼首草和灰兜巴）進(jìn)行全成分提取，最終獲得58個(gè)提取物。
　　為明確這12種天然藥物的PPARs活性部位，用構(gòu)建好的PPARs高通量篩選模型，對

5、58個(gè)提取物先開展了PPARγ和PPARβ的活性篩選試驗(yàn)。證實(shí)12種藥物的提取物中，只有澤瀉對PPARγ或PPARβ均無激活作用；而58個(gè)提取物中共有26個(gè)提取物對PPARγ和PPARβ同時(shí)具有激活作用。其中有3個(gè)提取物，即綠蘿花的乙酸乙酯萃取物（EB1）和正己烷提取物（EA）、翼首草的EA，在測試的濃度范圍內(nèi)，對PPARγ和PPARβ的最高激活倍數(shù)，均高于陽性對照的激活能力。
　　根據(jù)上述活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對其中10個(gè)具有PPARγ

6、/β高活性的提取物，進(jìn)一步開展PPARα活性實(shí)驗(yàn)，以期找到PPARs泛激動部位。結(jié)果表明，這10個(gè)提取物對PPARα均有激活作用，激活能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋ㄏ鄬τ谕侮栃运幍谋戎担阂硎撞?EA＞綠蘿花 EB1＞豬牙皂 EB1＞綠蘿花 EA＞林檎葉水提物上清液部分（EC）＞翼首草EB3＞翼首草EB1＞林檎葉EB1＞翼首草EC＞川黃連EB1。這5種天然藥物很可能是通過激活PPARs來發(fā)揮降糖、降脂和抗炎作用的。在此，本研究首次發(fā)現(xiàn)，天然藥物

7、的大極性提取物，即林檎葉的EC部分對PPARβ和PPARα；翼首草的EC對PPARγ和PPARα，具有明顯的激活作用，激活倍數(shù)甚至高于同批次的陽性藥物。
　　然后，為確定PPARs高活性提取物中是否含有PPARs泛激動劑，對部分二級組分和單體化合物進(jìn)行了活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：（1）從綠蘿花EB1中獲得的11個(gè)二級組分，均能激活PPARγ和PPARβ；（2）首次發(fā)現(xiàn)，來自綠蘿花EB1的9個(gè)單體化合物中，傘形花內(nèi)酯和十五烷酸對PPARγ

8、和PPARβ同時(shí)表現(xiàn)出激活作用，最高激活倍數(shù)分別是1.78倍和1.92倍，及1.74倍和5.91倍；（3）首次在細(xì)胞水平上證實(shí)，小檗堿是PPARs的泛激動劑；
　　最后，對具有PPARs活性的10個(gè)提取物、綠蘿花EB1的11個(gè)二級組分，及3個(gè)單體化合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行了初步探討。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有5個(gè)提取物（綠蘿花的EA和EB1、翼首草的EB3、林檎葉的EC和豬牙皂的EB1），以及綠蘿花EB1的11個(gè)二級組分和單體化合物（傘形花

9、內(nèi)酯和十五烷酸）在獲得PPARs最高激活倍數(shù)下的作用濃度，均不會抑制ECV-304細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的增殖；另外5個(gè)提取物，除了翼首草的EA部分和黃連的EB1部分，其他3個(gè)活性部位（林檎葉EB1、翼首草的EB1和EC）對這兩種細(xì)胞增殖的抑制率均低于30.0%；小檗堿對這兩種細(xì)胞的抑制率則分別為21.9%和31.3%。
　　綜上所述，本文在HeLa細(xì)胞上構(gòu)建了一種以PPARα/β/γ為靶點(diǎn)的高通量篩選模型，能有效地從成分復(fù)雜