抗糖尿病化合物篩選模型的建立和應(yīng)用.pdf

1、糖尿病是由于體內(nèi)胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的以高血糖和糖尿?yàn)樘卣鞯膬?nèi)分泌代謝疾病，現(xiàn)己成為僅次于心血管疾病和癌癥的第三大危害人類健康的疾病。其中Ⅱ型(NIDDM)占80％以上。 目前，已有多種類型的抗糖尿病藥物在臨床應(yīng)用，主要有胰島素、胰島素類似物、磺酰脲類、雙胍類、噻唑烷二酮(TZD)類等，但存在使用不方便、療效低或毒性大等問題。而抗糖尿病中藥的成分復(fù)雜，多為復(fù)方制劑，物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚，對(duì)申請(qǐng)專利帶來較多不便。因此，開發(fā)新作

2、用機(jī)制或新結(jié)構(gòu)類型的高效低毒的抗糖尿病藥物已成為國際上新藥研發(fā)的重點(diǎn)。 本研究分別在細(xì)胞和分子水平上建立藥物篩選模型，對(duì)天然小分子化合物進(jìn)行降糖活性篩選，并進(jìn)一步在動(dòng)物模型上證實(shí)其抗糖尿病藥理活性，以期待發(fā)現(xiàn)具有新作用機(jī)制或新結(jié)構(gòu)類型的抗糖尿病藥物：[1]在細(xì)胞水平上建立脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗模型，對(duì)230個(gè)天然小分子化合物進(jìn)行初步篩選。用體外激素誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞后，加入不同濃度的小分子化合物，設(shè)為5

3、0、5、0.5 mg·L<'-1>，以胰島素10 mg·L<'-1>為陽性對(duì)照，48 h后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖濃度，考察不同化合物促脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗作用。結(jié)果顯示其中63個(gè)化合物有不同程度的促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗作用，其中第33、51、96、200、202、211、212、213號(hào)化合物在50 mg·L<'-1>及170號(hào)在5 mg·L<'-1>濃度時(shí)呈現(xiàn)較強(qiáng)的降糖活性；[2]建立基于PPAR<,γ>信號(hào)通路的藥物篩選模型。從初篩

4、出的63個(gè)化合物中進(jìn)一步篩選具有。PPAγ受體激活活性的小分子化合物。先利用報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)，構(gòu)建含有PPRE片段的報(bào)告基因質(zhì)粒，將該報(bào)告基因質(zhì)粒與表達(dá)PPARY的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，設(shè)定10、1.0 mg·L<'-1>兩個(gè)化合物加藥濃度，以馬來酸羅格列酮為陽性對(duì)照，考察對(duì)PPARγ信號(hào)通路的激活活性。從中我們又進(jìn)一步篩選出7個(gè)化合物，其中，60號(hào)化合物在1 mg·L<'-1>濃度時(shí)測(cè)得報(bào)告基因表達(dá)率在2倍以上，與10 u mg·L<'

5、-1>馬來酸羅格列酮的結(jié)果無顯著性差異(p>0.05)；(3)建立ALX致糖尿病小鼠模型，對(duì)最終篩出的7個(gè)化合物中的4個(gè)(51、60、192、203號(hào))在動(dòng)物體內(nèi)的降糖活性進(jìn)行檢驗(yàn)。給KM小鼠尾靜脈注射ALx造模，陽性對(duì)照品MET設(shè)為250 mg·Kg<'-1>·d<'-1>，51號(hào)化合物按12.5、25、50 mg·Kg<'-1>·d<'-1>劑量，60、192、203號(hào)化合物按25、50、100 mg·Kg<'-1>·d<'-1>劑

6、量分別灌服給藥7 d，分別在給藥的4、7 d取尾靜脈血測(cè)血糖值，考察不同化合物在不同劑量下對(duì)糖尿病模型小鼠血糖的影響。結(jié)果顯示51號(hào)化合物以25 mg·Kg<'-1>·d<'-1>、60號(hào)化合物以100mg·Kg<'-1>·d<'-1>、203號(hào)化合物以100 mg·Kg<'-1>·d<'-1>劑量給小鼠灌服7 d后，小鼠血糖與模型對(duì)照組比較明顯下降(p<0.05)；192號(hào)化合物以各劑量給藥條件下，小鼠血糖與模型對(duì)照組比較變化不明顯(

7、p>0.05)。通過本實(shí)驗(yàn)成功建立二個(gè)體外初篩模型和一個(gè)整體動(dòng)物模型。脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗模型具有成本低、所需樣品量少、篩選效率高等特點(diǎn)，但模型的穩(wěn)定性和特異性存在一定缺陷；基于PPARγ信號(hào)通路的初篩模型，具有靶點(diǎn)單一、機(jī)制明確等特點(diǎn)，模型具較好的特異性和穩(wěn)定性；ALX誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型形成率高，死亡率低，模型穩(wěn)定性好；對(duì)230個(gè)化合物進(jìn)行篩選，得到63個(gè)具有不同程度促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗作用的化合物，其中，7個(gè)化合物對(duì).PPARγ信