二型大麻受體激動劑篩選模型的建立及活性藥物的篩選.pdf

1、背景與目的：藥物的活性篩選是研制新藥的起點和具有決定意義的步驟。隨著分子藥理學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的進(jìn)展，高通量篩選已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新藥的重要手段之一。采用高通量篩選模型可以在短時間內(nèi)高效的篩選出先導(dǎo)化合物，進(jìn)而用于新藥的研發(fā)。G蛋白偶聯(lián)受體作為藥物靶點被廣泛研究。根據(jù)受體-配體相互作用的理論建立起來的篩選方法，可以發(fā)現(xiàn)能夠與G蛋白偶聯(lián)受體相結(jié)合的化合物。
　　二型大麻受體(Cannabiniod receptor two，

2、CB2)為大麻受體(Cannabiniod receptor)的一種亞型。它由360個氨基酸組成，為7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體。CB2受體主要分布于與免疫功能相關(guān)的外周組織中，包括巨噬細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞。生理狀態(tài)下在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有分布，但表達(dá)量很低。此外，在子宮、胃腸道等部位也有CB2受體的分布。大量的研究表明，CB2受體在許多疾病的病理過程中起著重要的調(diào)控作用。CB2激動劑具有抑制炎癥反應(yīng)、改善微循環(huán)、抗癌、鎮(zhèn)痛等作用。因此，研究開發(fā)出具

3、有CB2活性的藥物，具有很大的醫(yī)用價值。
　　本課題研究旨在建立以雙熒光素酶報告基因檢測的二型大麻受體激動劑的篩選模型。在模型建立成功的基礎(chǔ)上，對一系列的中藥單體和提取物進(jìn)行初步篩選。以期能從其中篩選到具有激動CB2活性的藥物，為新藥研制做初步研究，同時使寶貴的中藥資源得到更有效的利用。
　　第一部分：二型大麻受體基因的pIRES2-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建及其真核表達(dá)
　　方法：首先采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase

4、 chain reaction，PCR)方法從質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CB2中擴(kuò)增獲得人的CB2基因，再采用基因重組技術(shù)將CB2的DNA片段插入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP。將獲得的pIRES2-EGFP-CB2重組子轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(HEK293)細(xì)胞，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)的表達(dá)情況，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Transcription polymeras

5、e chainReaction，RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)檢測CB2的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：酶切和測序結(jié)果驗證真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-CB2構(gòu)建成功。RT-PCR與Western blot分別檢測到CB2 mRNA與蛋白的表達(dá)，在熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了表達(dá)載體pIRES2-EGFP-CB2，并實現(xiàn)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
　　第二部分：穩(wěn)定表達(dá)二型大

6、麻受體及雙熒光素酶報告基因的細(xì)胞株的建立
　　方法：將目的基因質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CB2、報告基因質(zhì)粒pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]、內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。采用G418與流式細(xì)胞儀篩選GFP陽性細(xì)胞，RT-PCR和Western blot驗證GFP陽性細(xì)胞中CB2 mRNA和蛋白的表達(dá)，熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況。利用報告基因法進(jìn)一步篩選穩(wěn)定表達(dá)雙熒光素酶報告基因的細(xì)胞株。

7、>　　結(jié)果：RT-PCR與Western blot鑒定穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株中有CB2受體的表達(dá)，在熒光顯微鏡能觀察到綠色熒光。通過檢測雙熒光素酶報告基因篩選出了最高活性比例的細(xì)胞株。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)CB2與雙報告基因的細(xì)胞株，為采用報告基因法高通量篩選CB2受體激動劑奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分：二型大麻受體激動劑篩選模型的考察及藥物的篩選
　　方法：優(yōu)化激動劑的濃度和作用時間并采用Z’因子、信號本底比、信噪比

8、等方法考察模型的穩(wěn)定性。此外，采用CB2拮抗劑AM630來驗證模型的特異性。在此基礎(chǔ)上，對100多種中藥單體及提取物進(jìn)行了篩選。
　　結(jié)果：在本次建立的雙報告基因篩選模型中，給予1μmol/LHU-308，6 h后能取得最大相對誘導(dǎo)率。篩選模型Z’因子為0.84，信號本底比為7.45，信噪比為66.65，表現(xiàn)為良好的穩(wěn)定性。以AM630作用于細(xì)胞可使熒光素酶報告基因活性與對照組相比顯著增強(qiáng)(P<0.001)，提示模型具有良好的特異