抗乙型肝炎病毒藥物的篩選及其活性成分的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV）是目前已知的最小動物嗜肝DNA病毒，其基因組結(jié)構(gòu)緊湊、功能高效。人類感染HBV后可引起急慢性肝炎，HBV DNA編碼的多種結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白抗原性很強，能激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答反應(yīng)而導(dǎo)致肝損傷，最終轉(zhuǎn)化為肝硬化和原發(fā)性干細(xì)胞癌。目前治療乙型肝炎多采用抗病毒、改善肝功能和免疫調(diào)節(jié)等聯(lián)合治療的方法，至今還沒有研究出一種能將HBV從患者體內(nèi)清除的特效藥。
　　國內(nèi)外公認(rèn)的如a-干擾素（IFN-a）和拉米

2、夫定（3-TC）等核苷類藥物對HBV有較好的抑制作用，但長時間用藥副作用大且產(chǎn)生耐藥株，停藥后易復(fù)發(fā)。我國具有幾千年利用中草藥治療疾病的經(jīng)驗，這就為從天然產(chǎn)物和傳統(tǒng)藥用植物中篩選高效低毒的抗HBV藥物或先導(dǎo)化合物提供一條有效的途徑。
　　本論文通過查閱相關(guān)文獻和《黎族藥志》，從中選取20種清熱、解毒、保肝和民間用于治療慢性肝炎的藥用植物。60％乙醇回流提取得到該20種藥用植物的醇提物，以HepG22.2.15細(xì)胞株為體外抗HBV活

3、性篩選模型，用MTT法檢測醇提物的細(xì)胞毒性；以ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV的HBsAg和HBeAg的滴度，最后以醇提物對HepG22.2.15細(xì)胞HBeAg分泌的抑制作用作為抗HBV活性篩選的指標(biāo)。實驗結(jié)果表明，最大無毒濃度時田基黃醇提物對HepG22.2.15細(xì)胞HBeAg分泌的抑制率最高，即為69.06%，IC50值為14.57μg/mL，治療指數(shù)TI>2。
　　田基黃醇提物用水分散，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，

4、得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水部位，用MTT和ELISA法對這四個部位進行體外抗HBV活性的評價，其中乙酸乙酯部位抗 HBV活性最強，最大無毒濃度時對HepG22.2.15細(xì)胞HBeAg分泌的抑制率為63.46%，IC50為111.07μg/mL，TI>2。采用硅膠、Sephadex LH-20及薄層色譜等方法對田基黃醇提物進行進一步活性追蹤分離。從田基黃乙酸乙酯的活性部位分離得到4個單體化合物。根據(jù)理化性質(zhì)、1H-NMR和13C-NM

5、R波譜數(shù)據(jù)分析鑒定了這4個化合物的結(jié)構(gòu)，分別為槲皮素-7-O鼠李糖苷（vincetoxicoside B）、（2R，3R）雙氫槲皮素-7-O-α-L鼠李糖苷（（2R,3R）-taxifolin-7-O-α-L-rhamnoside）、槲皮苷（quercitrin）和1，3，6，7-四羥基呫噸酮（1，3，6，7-tetrahydorxxynahtnoni）。其中化合物4是體外抗乙型肝炎病毒活性最高的化合物，其對HepG22.2.15細(xì)胞H

6、BeAg分泌的抑制率最高，為67.66%，IC50值為40.25μg/mL，治療指數(shù)TI>2。
　　本論文只對本次實驗體外篩選的田基黃醇提物及化合物4和以前實驗室體外篩選出來的活性較高的金蕎麥、石花醇提物進行了初步定性的體內(nèi)抗HBV活性的評價。北京鴨感染DHBV第7天開始給藥，醇提物的高劑量組為26mg/kg，低劑量組為6.5 mg/kg，化合物4的高劑量組為80mg/kg，低劑量組為20mg/kg，一天2次，連續(xù)給藥10天。結(jié)果