人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞過程中的基本特征及機制研究.pdf

1、肥胖的產(chǎn)生不僅是由于脂肪細(xì)胞增大引起的,還有另外一個重要因素是脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加。脂肪細(xì)胞數(shù)目的增多來源于存在于脂肪組織內(nèi)多潛能干細(xì)胞的成脂分化,甚至在某些因素的刺激下,其它器官的干細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也可能會募集到脂肪組織分化為脂肪細(xì)胞。目前對于脂肪細(xì)胞分化的研究主要集中于小鼠前脂肪細(xì)胞到成熟脂肪細(xì)胞這個階段,但是對于間充質(zhì)干細(xì)胞特別是人來源的間充質(zhì)干細(xì)胞如何分化為脂肪細(xì)胞這一過程了解甚少。因此,本課題研究的主要目的是觀察人骨髓間充

2、質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞過程中的基本特征,包括增殖特性和參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的作用。
　　本課題中,我們利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)的方法從人骨髓中成功分離了間充質(zhì)干細(xì)胞。從形態(tài)上觀察,體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成梭形,生長比較緩慢,細(xì)胞缺乏接觸抑制的特性,生長致密的克隆中心細(xì)胞成多層生長。流式細(xì)胞檢測90％以上的細(xì)胞處以G0/G1期。人骨髓間充質(zhì)在體外只能進行有限傳代,多次傳代后細(xì)胞出現(xiàn)復(fù)制性老化,大概能傳至第12代。
　　進

3、一步我們用含10％胎牛血清,0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,Mix),1μM地塞米松(Dexamethasone,Dex),10μg/ml胰島素(Insulin),100μM吲哚美辛(Indo,Indomethacin)的培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞。按照MDI+Indo處理3天,接著胰島素維持1天,如此反復(fù)處理細(xì)胞至12天,最后用僅含胰島素的培養(yǎng)液維持至21天。細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后絕大多數(shù)細(xì)胞分

4、化為成熟的脂肪細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞胞體由原米的梭形變?yōu)閳A形,細(xì)胞內(nèi)有甘油三酯聚積。同時用Real-time PCR的方法檢測脂肪細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)脂肪酸結(jié)合蛋白(422/aP2)隨分化的過程表達(dá)增加。另外,脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ在激素誘導(dǎo)過程中并沒有顯著變化,至分化后期有所下降。C/EBPα和PPARγ激素處理后表達(dá)增加。
　　以往的研究表明接觸抑制的小鼠3T3-L1細(xì)胞分化時會重新進入細(xì)胞周期(MCE,mitoti

5、c clonal expansion有絲分裂克隆擴增),我們的研究發(fā)現(xiàn)人脂肪組織干細(xì)胞成脂分化時沒有經(jīng)歷MCE。在我們的研究中,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因為其生長特性,細(xì)胞在分化之前不能接觸抑制和同步化,分化前后細(xì)胞計數(shù)結(jié)果表明,細(xì)胞分化處理結(jié)束后,未處理的對照組細(xì)胞數(shù)量相對誘導(dǎo)分化前還有一定量增加,而分化處理組的細(xì)胞數(shù)量少于對照組,并且刺激次數(shù)越多,分化細(xì)胞的比例越高,最終細(xì)胞數(shù)量與未誘導(dǎo)組相比增加越少。提示細(xì)胞分化時沒有經(jīng)過分裂。進一步我

6、們在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化24小時后加入BrdU孵育48小時,到細(xì)胞分化成熟后檢測BrdU摻入和分化脂肪細(xì)胞的關(guān)系,結(jié)果顯示有部分細(xì)胞摻入BrdU,說明這些細(xì)胞還在增殖,但這些細(xì)胞均沒有分化為脂肪細(xì)胞,胞漿內(nèi)沒有脂滴出現(xiàn);而有脂滴積聚的脂肪細(xì)胞其核內(nèi)均沒有BrdU摻入。對照的3T3-L1可見絕大多數(shù)分化的細(xì)胞有BrdU摻入。這些結(jié)果提示,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1不同,分化時并不需要經(jīng)過有絲分裂克隆擴增的調(diào)節(jié)過程

7、。
　　人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中C/EBPβ的表達(dá)量在激素處理的過程中并沒有顯著的變化。但是當(dāng)我們用RNA干擾的方法敲低C/EBPβ的表達(dá)后,細(xì)胞成脂分化能力顯著降低,提示C/EBPβ在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的過程中是必須的。進一步我們利用腺病毒過表達(dá)系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)C/EBPβ,觀察到C/EBPβ聯(lián)合PPARγ的激動劑吲哚美辛使脂肪細(xì)胞的分化增加,說明C/EBPβ可以促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化,但必須依賴PPA

8、Ry的激活。過表達(dá)C/EBPα對細(xì)胞分化的影響類似于C/EBPβ的作用,可以促進細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化,但必須同時激活PPARγ。但是在相同MOI情況下,C/EBPα促進細(xì)胞成脂分化的作用小于C/EBPβ的作用。另外隨著MOI的升高,C/EBPβ和C/EBPα均表現(xiàn)出抗細(xì)胞增殖和促進凋亡的作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過表達(dá)。PPARγ能夠促使細(xì)胞分化,并且不需要激素MDI的作用,加入PPARγ的激動劑能夠增強這種效果。但是PPARγ的過表達(dá)和激活

9、后分化細(xì)胞內(nèi)的脂滴明顯小于用MD1+Indo誘導(dǎo)分化的細(xì)胞,提示PPARγ可能起始了脂肪細(xì)胞的分化但是脂質(zhì)代謝還需要其它基因激活參與。另外過表達(dá)PPARγ使微絲蛋白β-actin的表達(dá)降低,但不影響β-tubulin的表達(dá),提示PPARγ可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化。
　　我們對于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞過程中的基本特征和參與調(diào)節(jié)脂肪分化的三個轉(zhuǎn)錄因子C/EBPp、C/EBPα和PPARγ的作用進行了初步探討