小鼠神經(jīng)干細胞免疫原性的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：小鼠神經(jīng)千細胞體外培養(yǎng)和鑒定
　　 本實驗借鑒了大量研究者的成功及失敗的經(jīng)驗，總結(jié)了本實驗室進行神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)十年來的體會，探索了一套行之有效的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及鑒定方法。
　　 材料和方法：
　　 1.材料:實驗動物BALB/c近交系新生鼠由浙江大學(xué)實驗動物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、B27添加劑、胰蛋白酶均購于Gibco公司，表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長

2、因子(bFGF)購于Sigma公司。一次性塑料培養(yǎng)瓶為Orange公司產(chǎn)品。
　　 2.方法
　　 2.1神經(jīng)干細胞培養(yǎng)
　　 取BALB/c新生鼠，以戊巴比妥鈉麻醉后處死，解剖并分離海馬組織，以PH為7.4的PBS緩沖液漂洗干凈后，將組織碎片置于試管中，加入0.5g/L的胰酶和0.12g/L的EDTA，37℃消化15min，然后以玻璃吸管吹散，細胞計數(shù)顯示，80％以上細胞活力良好。利用無血清培養(yǎng)基，及瓊脂糖包被

3、的培養(yǎng)瓶，懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，傳代并做單克隆擴增和分化。
　　 2.2神經(jīng)干細胞鑒定
　　 應(yīng)用CD133免疫細胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)干細胞。
　　 結(jié)果：
　　 1.神經(jīng)干細胞培養(yǎng)
　　 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)第一天，呈單細胞懸液，第二天細胞逐漸聚集成小的神經(jīng)球，第三天左右出現(xiàn)神經(jīng)干細胞克隆，神經(jīng)球逐漸增大，最終形成巨大神經(jīng)球，中心神經(jīng)干細胞因難以獲得養(yǎng)分，此時需要重新消化，傳代培養(yǎng)。
　　 2.神

4、經(jīng)干細胞的鑒定
　　 無血清培養(yǎng)條件下，按克隆密度種植的神經(jīng)干細胞分裂增殖逐漸形成克隆球，表明本實驗組神經(jīng)干細胞具有自我增殖能力。神經(jīng)干細胞克隆球球在含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐漸發(fā)生貼壁生長，并分化神經(jīng)膠質(zhì)細胞及少量神經(jīng)元細胞，表明本實驗組神經(jīng)干細胞具有多向分化潛能。神經(jīng)干細胞克隆球經(jīng)經(jīng)短時消化及機械吹散后，形成神經(jīng)干細胞小克隆球及單細胞懸液，甩片收集后行CD133免疫熒光染色，均呈陽性，表明本實驗組細胞

5、均為神經(jīng)干細胞。結(jié)論
　　 利用機械分離法和改進的酶消化法相結(jié)合的細胞分離培養(yǎng)方法，采用加入絲裂原的無血清培養(yǎng)基，及瓊脂糖凝膠包被的培養(yǎng)瓶，選擇適當?shù)慕臃N密度和傳代培養(yǎng)時機，能夠長期獲得足夠數(shù)量的高純度神經(jīng)干細胞。
　　 第二部分：單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗檢測小鼠神經(jīng)干細胞與同一個體肝臟細胞免疫原性的差異
　　 本研究試圖探討小鼠神經(jīng)干細胞免疫原性與自身肝臟細胞之間的差異，從而了解其免疫原性的強弱，以利于解決神經(jīng)

6、干細胞移植中的免疫排斥問題。
　　 材料和方法：
　　 1.材料
　　 實驗動物C57BL/6近交系小鼠和BALB/c近交系新生鼠均由浙江大學(xué)實驗動物中心提供。
　　 2.方法
　　 2.1神經(jīng)干細胞培養(yǎng)和鑒定
　　 取BALB/c新生鼠，以戊巴比妥鈉麻醉后處死，解剖并分離海馬組織，加入0.5g/L的胰酶和O.12g/L的EDTA，37℃消化15min，然后以玻璃吸管吹散。利用無血清培養(yǎng)，

7、懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，傳代并做單克隆擴增和分化，應(yīng)用CD133免疫細胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)干細胞。
　　 2.2主動免疫C57BL/6近交系小鼠
　　 將制備的NSCs，以絲裂霉素滅活后分別腹腔免疫C57BL/6小鼠15只，l×106細胞/只，1次/周，連續(xù)3周，最后1次免疫后第4天處死小鼠。
　　 2.3單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗
　　 無菌條件下摘取C57BL/6免疫小鼠小鼠脾臟，制備T淋巴細胞懸液。調(diào)整T淋

8、巴細胞懸液密度為l×109/L，以每孔100μL體積加入圓底96孔板，作為應(yīng)答細胞。然后將制備的C57BL/6小鼠神經(jīng)干細胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為2x108/L后，絲裂霉素處理30 min，PBS洗滌后用培養(yǎng)液重懸，再按每孔100μl加入到已鋪有受體淋巴細胞的96孔板中，作為刺激細胞。刺激細胞與應(yīng)答細胞比例為1:5，使神經(jīng)干細胞和淋巴細胞充分接觸。再置于孵箱中培養(yǎng)120h。培養(yǎng)結(jié)束前16h，加入[3H]-TdR。
　　 2.4

9、液閃計數(shù)儀檢測
　　 以多頭細胞收集儀將細胞收集到濾紙上，液閃計數(shù)儀檢測細胞內(nèi)摻入[3H]-TdR后形成的每分鐘脈沖數(shù)，即cpm值，每組結(jié)果以3孔的平均值計算。
　　 2.5肝細胞對照組
　　 取BALB/c新生鼠，無菌條件下摘取肝臟，應(yīng)用seglen灌流法制備肝細胞，上述同樣方法腹腔免疫C57BL/6小鼠，收獲T淋巴細胞。然后取同一批肝細胞，以絲裂霉素滅活后與收獲T淋巴細胞行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，用[3H]-T

10、dR標記并檢測cpm值。
　　 2.6統(tǒng)計學(xué)處理
　　 計量資料用X±S表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗。
　　 結(jié)果：
　　 與肝細胞對照組比較，NSC組合成代謝中攝取的[3H]-TdR較少，因而液閃計數(shù)儀檢測所得cpm值較小。兩組cpm值的比較，P<0.001，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 綜上所述，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，小鼠神經(jīng)干細胞免疫原性明顯低于同一個體的肝細胞。長期的肝

11、移植基礎(chǔ)及臨床研究表明，肝細胞具有較弱的免疫原性。因而我們有理由推測，神經(jīng)干細胞的免疫原性低于其普通的體細胞。鑒于肝細胞的免疫原性已經(jīng)得到廣泛研究證實，所以本實驗選擇了肝細胞作為實驗對照，但僅以肝細胞作為對照是不夠的，因此這一方面尚有待于進一步深入研究。
　　 第三部分:應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達并比較炎癥因子IL-2存在條件下MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達量的變化
　　 本研究試圖

12、檢測體外培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)干細胞主要組織相容性抗原的表達量，以及炎癥因子存在條件下其表達量的變化。從而了解小鼠神經(jīng)干細胞免疫原性的特點，為臨床解決神經(jīng)干細胞移植中的免疫排斥問題提供實驗依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1.材料
　　 實驗動物BALB/c近交系新生鼠均由浙江大學(xué)實驗動物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、B27添加劑、胰蛋白酶均購于Gibco公司，表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子及白介素-2購于Si

13、gma公司。一次性塑料培養(yǎng)瓶為Orange公司產(chǎn)品，小鼠MHC-Ⅰ單克隆抗體及小鼠MHC-Ⅱ單克隆抗體均購自eBioscience。
　　 2.方法
　　 2.1神經(jīng)干細胞培養(yǎng)和鑒定
　　 取BALB/c新生鼠，以戊巴比妥鈉麻醉后處死，解剖并分離海馬組織，加入0.5g/L的胰酶和O.12g/L的EDTA，37℃消化15min，然后以玻璃吸管吹散。利用無血清培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，傳代并做單克隆擴增和分化，應(yīng)用C

14、D133免疫細胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)干細胞。
　　 2.2流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)干細胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達
　　 取生長良好的BALB/c神經(jīng)干細胞1瓶，離心收集細胞，消化30分鐘左右，間斷輕輕吹打成單細胞懸液，離心收集細胞，SFM重懸細胞，移入流式試管，隨機分為12管，細胞數(shù)約5000/管。先取2管分別加入“FITC標志的MHC-Ⅰ抗體/PE標志的同種型對照”和“PE標志的MHC-Ⅱ抗體/FITC標志的同種型對照”各1

15、微升，設(shè)置機器本底。然后將其余10管離心后，加入FITC標記的anti-mouse MHCclassⅠ及PE標記的anti-mouse MHC classⅡ各1微升，常溫下作用15分鐘。以PBS400微升洗滌一遍后，再以PBS400微升重懸，然后利用流式細胞儀檢測NSC中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽性細胞比例。取10管的平均值為神經(jīng)干細胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽性細胞比例。
　　 2.3流式細胞術(shù)檢測炎癥因子IL-2存在條件下神經(jīng)干

16、細胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達量的變化
　　 取生長良好的BALB/c神經(jīng)干細胞3瓶，消化后接種入5ml培養(yǎng)瓶，共25瓶。隨機分成5組，每組5瓶：按時間點：24小時、3天、7天、14天，以lOng/ml的濃度，分別加入IL-2;另設(shè)陰性對照組。收集各組細胞，移入流式試管，細胞數(shù)約5000/管。然后將各組細胞離后，每管加入FITC標記的anti-mouse MHC classⅠ及PE標記的anti-mouse MHC class

17、Ⅱ（I-A/I-E)各1微升，分別標記MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ，常溫下作用15分鐘。然后利用流式細胞儀檢測NSC中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽性細胞比例。取5管的平均值為每組神經(jīng)干細胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽性細胞比例。
　　 2.4統(tǒng)計學(xué)處理
　　 計量資料用X±S表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗。
　　 結(jié)果：
　　 1流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)干細胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達結(jié)果顯示，僅約18.46％增殖期NS

18、C表達上述二類分子，而達81.54％的增殖期NSC沒有檢測到這二類分子的表達，且MHC-Ⅰ類分子的平均表達比例略高于MHC-Ⅱ類分子。
　　 2流式細胞術(shù)檢測炎癥因子IL-2存在條件下神經(jīng)干細胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達量的變化結(jié)果顯示，炎癥因子IL-2存在條件下，各組與對照組相比，MHC-Ⅰ類分子及MHC-Ⅱ類分子的比例均有不同程度的上調(diào)，P<0.01，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。作用24小時至14天，4個時間點上，神經(jīng)干細胞MHC