中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位腺病毒核酸疫苗的制備及免疫效果評價.pdf

1、第一部分覆蓋中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位的確定及預(yù)測 目的：覆蓋中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位的確定及預(yù)測。 方法： 1、根據(jù)山東大學(xué)衛(wèi)生系統(tǒng)計教研室薛付忠老師建立的中國HLA-Ⅰ積累表型頻率（CPF）空間預(yù)測系統(tǒng)依次預(yù)測A2，A24，A1，A3，A11，A68，B44，B7，A23，A26，B35，B38，B8，B27十四個基因位點在中國人群的覆蓋率（CPF值），評價和預(yù)測HLA特異的HCMV串聯(lián)

2、表位核酸疫苗在中國不同地理位置上人群內(nèi)的免疫效果； 2、利用從1996年以來發(fā)表在PubMed上被SCI收錄的23篇研究HCMV表位的文獻(xiàn)，從中選擇能針對HCMV多種蛋白抗原的多個CTL表位、Th表位和B細(xì)胞表位，能夠激發(fā)機體的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，且能與HLA-Ⅰ分子和HLA-Ⅱ分子的基因位點穩(wěn)定結(jié)合的表位； 3、利用SYFPEITHI MHC表型及表位預(yù)測系統(tǒng)和MAPPP蛋白酶體降解預(yù)測系統(tǒng)對所選表位進(jìn)行表位肽

3、預(yù)測和MAPPP蛋白酶體切割-表位生成預(yù)測； 4、從PubMed Nucleotide NC_001347.人巨細(xì)胞病病毒AD169株各蛋白的基因序列中找出各表位相對應(yīng)的核苷酸序列并核對，將各表位的核苷酸序列按等位基因的頻率分布順序排列起來，串聯(lián)成一條核苷酸序列； 5.根據(jù)Kozak規(guī)則引入Kozak序列以獲得HCMV串聯(lián)表位核苷酸序列在真核表達(dá)載體中的高效表達(dá)； 6.將HCMV串聯(lián)表位的核苷酸序列輸入DNAMA

4、N軟件，根據(jù)輸出的酶切位點結(jié)果結(jié)合所要構(gòu)建入穿梭載體的多克隆位點，確定串聯(lián)表位核苷酸序列兩端的酶切位點。 結(jié)論： 1、根據(jù)山東大學(xué)衛(wèi)生系統(tǒng)計教研室薛付忠老師建立的中國HLA-Ⅰ積累表型頻率（CPF）空間預(yù)測系統(tǒng)，對所選HCMV表位結(jié)合的14個HLA基因位點及其組合進(jìn)行了預(yù)測，顯示A2，A24，A1，A3，A11五個優(yōu)勢基因位點的CPF值是88.1％，；A2，A24，A1，A3，A11，A68，B44，B7，A23，A26

5、，B35，B38，B8，B27十四個基因位點的CPF值是92.1％，顯示HLA特異的HCMV串聯(lián)表位核酸疫苗在中國人群的覆蓋頻率達(dá)90％以上，預(yù)測了HLA特異的HCMV串聯(lián)表位核酸疫苗在中國不同地理位置上人群內(nèi)的免疫效果，理論上其免疫效果可達(dá)90％以上。 2、我們選擇了HCMV的十五種抗原蛋白pp28，pp50，pp65，pp150，pp71，gH，gB，IE-1，IE-2，US2，US3，US6，US11，UL16，UL18，

6、分別在病毒的黏附、復(fù)制、組裝及再激活過程中表達(dá)，在這些抗原中選取了84個表位，其中針對HLA-Ⅰ分子基因位點的CTL表位76個，針對HLA-Ⅱ分子基因位點的Th表位7個，能激發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體的B細(xì)胞表位1個，通過啟動針對上述抗原表位的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，理論上可以在各個階段控制病毒的復(fù)制，防止HCMV疾病的形成。 3、應(yīng)用DNAMAN軟件、Kozak規(guī)則及PubMed Nucleotide NC 001347.Human he

7、rpesvirus 5 strain AD169 HCMV基因組得出了覆蓋中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位核苷酸序列，在起端加上了Kozak序列，可以獲得串聯(lián)表位核苷酸序列在真核表達(dá)載體中的高效表達(dá)；末端加上了6個His標(biāo)簽序列，可以通過6個His抗體應(yīng)用Western blot及細(xì)胞免疫組化檢測HCMV串聯(lián)表位的表達(dá)；起始兩端加入了NheⅠ和NotⅠ酶切位點，可以插入穿梭載體pHMCMV5載體的多克隆位點，為制備中國人群HLA特異

8、的HCMV串聯(lián)表位腺病毒載體核酸疫苗打下了基礎(chǔ)。 第二部分 中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位腺病毒核酸疫苗的制備 目的：HCMV感染是引起移植患者和新生兒高發(fā)病率和死亡率的原因，世界范圍的醫(yī)學(xué)會組織指出應(yīng)優(yōu)先發(fā)展控制HCMV疾病的疫苗，盡管做出了很大的努力但目前仍無被臨床許可的疫苗：嵌合型復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad5F35比傳統(tǒng)的Ad5型具有更好的趨向性和更高的容納外源基因的能力，在多種細(xì)胞上高效表達(dá)外源基因。本實驗

9、應(yīng)用嵌合型Ad5F35構(gòu)建多重HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ分子限制CTL、Th多表位核酸疫苗Ad5F35-CTL·Th以及針對體液免疫應(yīng)答的HCMV線性B細(xì)胞表位核酸疫苗Ad5F35-AD-1。 方法： 1、采用重疊區(qū)擴增基因拼接法（Gene splicing by overlap extension，SOEing）和PCR技術(shù)合成HCMV串聯(lián)T細(xì)胞表位全長基因； 2、應(yīng)用PCR技術(shù)從HCMV AD169全基因組擴增線

10、性B細(xì)胞表位gB AD-1的基因； 3、利用同源重組技術(shù)從穿梭載體，將CTL·Th和AD-1基因分別插入pHMCMV5的NheⅠ/NotⅠ和KpnⅠ/Afl Ⅱ酶切位點，構(gòu)建穿梭載體pHMCMV5-CTL·Th和pHMCMV5-AD-1，應(yīng)用NheⅠ/NotⅠ和KpnⅠ/ArlⅡ酶切分析和測序分析鑒定目的載體； 4、利用Ⅰ-CeuⅠ/PⅠ-SceⅠ雙酶切和體外重組技術(shù)將穿梭載體上包含CMV啟動子、目的基因、SV40 p

11、olyA尾的表達(dá)盒插入腺病毒表達(dá)載體pAd5F35，構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體Ad5F35-CTL·Th和pAd5F35-AD-1，應(yīng)用XhoⅠ和Ⅰ-CeuⅠ /PⅠ-SceⅠ酶切分析和測序分析鑒定目的載體； 5、應(yīng)用PacⅠ線性化重組腺病毒表達(dá)載體Ad5F35-CTL·Th和pAd5F35-AD-1，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HEK293，包裝重組腺病毒Ad5F35-CTL·Th和Ad5F35-AD-1，待培養(yǎng)10天出現(xiàn)CPE效應(yīng)時收取

12、病毒； 6、應(yīng)用HEK293細(xì)胞大量擴增重組腺病毒Ad5F35-CTL·Th和Ad5F35-AD-1，擴增至五代，應(yīng)用快速腺病毒感染性滴度（TCID50）檢測試劑盒測定大量擴增后的的重組腺病毒的滴度； 7、用重組腺病毒Ad5F35-CTL·Th和Ad5F35-AD-1分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用RT-PCR和Western blot技術(shù)分析CTL·Th和AD-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)； 8、用重組腺病毒Ad

13、5F35-CTL·Th和Ad5F35-AD-1分別轉(zhuǎn)染PBMC，利用細(xì)胞免疫化學(xué)和臺盼蘭染色分析重組腺病毒在PBMC上的表達(dá)和對PBMC活性的影響。 結(jié)論： 1、我們成功制備出中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)T細(xì)胞表位腺病毒載體核酸疫苗Ad5F35-CTL·Th和針對體液免疫應(yīng)答的HCMV線性B細(xì)胞表位腺病毒載體核酸疫苗Ad5F35-AD-1，為下一步的免疫應(yīng)答實驗打下了基礎(chǔ)。 2、重組腺病毒疫苗Ad5F35-C

14、TL·Th和Ad5F35-AD-1可以在PBMC高效表達(dá)目的蛋白，且不影響PBMC的活性。 第三部分 中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位腺病毒核酸疫苗體外免疫效果評價 目的：過繼免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫在控制HCMV感染方面起關(guān)鍵作用。本實驗評價中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位腺病毒核酸疫苗的體外免疫效果。 方法： 1、用EBV轉(zhuǎn)化PBMC，建立類淋巴母細(xì)胞系（lymphoblastoid ce

15、ll lines-LCL）； 2、應(yīng)用HCMV多表位腺病毒載體疫苗Ad5F35-CTL·Th刺激HCMV健康攜帶者的外周血單個核細(xì)胞（PBMC），體外擴增抗原特異性CTL； 3、應(yīng)用抗原特異性CTL進(jìn)行細(xì)胞毒試驗，檢測CTL的殺傷活性； 4、應(yīng)用ELISPOT實驗檢測Ad5F35-CTL·Th刺激HCMV健康攜帶者的PBMC后和抗原特異性CTL分泌IFN-γ的情況； 5、細(xì)胞內(nèi)染色法檢測Ad5F35-C

16、TL·Th刺激HCMV健康攜帶者的PBMC后CD8+T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)。 結(jié)論： 1、本實驗顯示了多表位抗原提呈系統(tǒng)擴增抗原特異性T細(xì)胞的有效性。 2、本試驗顯示了HCMV多表位腺病毒核酸疫苗可以高效擴增免疫顯性和亞顯性的抗原特異性T細(xì)胞。 3、實現(xiàn)了單個表達(dá)結(jié)構(gòu)可以擴增免疫顯性和亞顯性的抗原特異性T細(xì)胞，較之以前擴增不同的抗原特異性T細(xì)胞需要不同的刺激策略具有強大的優(yōu)勢。 4、我們的多表位重組