J亞群禽白血病病毒多表位蛋白質(zhì)疫苗和DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果評價.pdf

1、J亞群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J，ALV-J)首次分離于上個世紀80年代的英國，是外源性ALV與宿主內(nèi)源性序列EAV-HP的重組體。ALV-J感染后會導致高發(fā)病率、雞體生長遲緩和腫瘤，給全世界的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。盡管一些國家的種禽公司已經(jīng)成功實現(xiàn)了種雞群ALV-J的凈化工作，但是由于ALV在養(yǎng)雞業(yè)的廣泛流行、我國養(yǎng)殖模式的多樣化、規(guī)模參差不齊等特點，在我國地方種雞群中進行ALV-

2、J的凈化工作還是一項巨大的挑戰(zhàn)。J亞群禽白血病的高發(fā)病率和宿主范圍的廣泛性使其成為獸醫(yī)工作者持續(xù)關注的焦點。疫苗免疫是一種劃算可行的控制臨床疾病的有效方式。ALV是一種主要通過垂直傳播的疾病，在宿主體內(nèi)容易引起免疫耐受而很難誘導特異性抗體的產(chǎn)生，給疫苗研究造成了很大的困難，目前尚無可用的ALV商品化疫苗。因此，研制一種有效、安全的疫苗來預防ALV-J的廣泛流行迫在眉睫。研究表明，單一抗原的免疫原性較差且誘導的免疫保護有限。一種以表位為基

3、礎的包含病原體多個保護性抗原表位的多表位疫苗可以克服這些缺點。本研究中設計和構(gòu)建了一個基于ALV-J NX0101毒株的嵌合多表位基因來制備相應的多表位疫苗，并評估了其在雞體內(nèi)的免疫效果及攻毒保護率，期望其誘導的免疫應答能抵抗ALV-J的感染，為探索ALV-J疫苗的研制提供方法和思路。
　　1、嵌合多表位基因的設計和構(gòu)建
　　通過生物信息學軟件及相關網(wǎng)站分析ALV-J中國典型毒株NX0101三個主要結(jié)構(gòu)基因gag、pol和e

4、nv所編碼蛋白的B細胞和T細胞表位，根據(jù)親水性、柔韌性、二級結(jié)構(gòu)、表面可及性等選擇標準，同時比較近幾年ALV-J流行毒株的同源性，結(jié)合相關文獻的研究報道，篩選出4段抗原表位集中且序列保守的區(qū)域Gag(278-376aa)，Pol(784-855aa)，Env(Gp85:145-156aa和Gp37:412-538aa)以柔性肽GAGS作為Linker，將篩選的4段抗原表位基因依次串聯(lián)成一條全新的嵌合多表位基因X。分析表明，構(gòu)建的嵌合多表

5、位基因X有良好的親水性、柔性及抗原性等，國內(nèi)外未見報道，該研究豐富了ALV-J結(jié)構(gòu)蛋白的生物信息學資料，為ALV-J嵌合多表位基因的原核表達及DNA疫苗的制備提供了基礎材料。
　　2、嵌合多表位基因的原核表達和特異性檢測
　　將構(gòu)建的嵌合多表位基因X用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后克隆入表達載體PET-30a(+)進行原核表達研究。通過優(yōu)化表達條件，確定了重組嵌合多表位蛋白X(rCMEPX)表達的最佳誘導溫度為37℃，誘導時間

6、為4h，IPTG濃度為0.5mM/mL。用臨床ALV-J陽性血清和陰性血清進行Western-blots分析，結(jié)果證明rCMEPX表達成功并且能與臨床ALV-J陽性血清發(fā)生特異性反應。間接ELISA實驗評估了rCMEPX與臨床ALV-J陽性血清反應的反應原性、特異性和敏感性。以純化的rCMEPX為抗原包被酶標板，篩選出rCMEPX的最佳包被濃度為0.125μg/mL，抗體最佳稀釋度為1:40，酶標二抗(HRP標記羊抗雞IgG)的最佳稀釋

7、度為1∶5000，血清樣品的陰陽性臨界值為0.152，以上實驗結(jié)果表明rCMEPX有良好的免疫反應性，為ALV-J蛋白質(zhì)疫苗的研制奠定了基礎。
　　3、嵌合多表位基因DNA疫苗的制備
　　將嵌合多表位基因X克隆入真核表達載體pVAX1來評估其作為DNA疫苗的潛力。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定真核表達質(zhì)粒構(gòu)建正確后，通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染DF-1細胞，利用間接免疫熒光檢測重組真核質(zhì)粒在體外的表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pVAX1-X的D

8、F-1細胞胞漿呈現(xiàn)特異性的綠色熒光而轉(zhuǎn)染了pVAX1質(zhì)粒的細胞無綠色熒光出現(xiàn)，表明嵌合多表位基因能在真核細胞中得到表達。大量提取并純化重組真核質(zhì)粒為ALV-J嵌合多表位基因DNA疫苗的制備提供了試驗材料。
　　4、嵌合多表位基因相關疫苗的制備及免疫效果評價
　　將構(gòu)建的嵌合多表位基因X分別制備相應的蛋白質(zhì)疫苗(rCMEPX)和DNA疫苗(pVAX-X)并評價了這兩種疫苗在雞體內(nèi)的免疫效果和攻毒保護率。結(jié)果表明該嵌合多表位蛋白