中國(guó)人群HLA-I類分子參與HCV1b型免疫逃逸突變的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　由于缺乏預(yù)防性疫苗且治療費(fèi)用昂貴，慢性丙型病毒性肝炎仍然是世界范圍內(nèi)重大的公共衛(wèi)生難題。目前丙型肝炎病毒（hepatitis C，HCV）感染慢性化機(jī)制尚不明確，有研究表明CD8+T細(xì)胞應(yīng)答失敗可能為HCV感染慢性化的重要機(jī)制之一。在歐美人群中的研究發(fā)現(xiàn)HCV病毒序列在宿主免疫壓力下能夠發(fā)生選擇性逃逸突變，進(jìn)而影響病毒特異性CTL應(yīng)答。中國(guó)人群與歐美人群遺傳背景不同，HCV在不同遺傳背景人群中的逃逸突變可能不同。目前在

2、中國(guó)乃至亞洲地區(qū)人群中尚無宿主遺傳背景對(duì)于HCV逃逸CTL應(yīng)答的研究。由于中國(guó)HCV主要基因型為1b型，且研究發(fā)現(xiàn)HCVNS3區(qū)存在較多CD8+T細(xì)胞表位，因此本研究擬擴(kuò)增湖北地區(qū)人群HCV1b型NS3區(qū)序列，分析湖北地區(qū)HCV1b型序列變異情況，序列進(jìn)化以及演變的規(guī)律；對(duì)湖北地區(qū)慢性 HCV1b型患者進(jìn)行HLA-A以及B類分子基因分型檢測(cè)，分析湖北地區(qū)人群HLA-I類分子遺傳背景與中國(guó)其他地區(qū)人群的異同之處，并比較數(shù)據(jù)庫中中國(guó)人群以及

3、德國(guó)人群HLA-A以及B類分子等位基因頻率的異同；分析中國(guó)慢性HCV1b型NS3區(qū)在HLA-I類分子免疫壓力下發(fā)生選擇性逃逸突變的情況，比較不同遺傳背景人群中HCV1b型NS3區(qū)選擇性逃逸突變的差異；驗(yàn)證HCV在HLA-I類分子限制性表位內(nèi)發(fā)生選擇性逃逸突變對(duì)于 CTL應(yīng)答的影響。旨在明確中國(guó)人群宿主免疫壓力下HCV1b型的選擇性逃逸突變情況，探尋中國(guó)人群中HCV1b型選擇性逃逸突變對(duì)HCV感染慢性化以及HCV特異性CTL應(yīng)答的影響及其

4、可能的機(jī)制。
　　方法
　　1.收集慢性HCV1b型感染患者全血，分離血清，抽提血清中HCV RNA，采用型別特異性引物擴(kuò)增法進(jìn)行HCV基因分型。對(duì)HCV1b基因型的HCV采用巢式PCR方法進(jìn)行NS3區(qū)擴(kuò)增并測(cè)序。使用生物信息學(xué)軟件將HCV1b型患者的HCV NS3區(qū)序列進(jìn)行序列比對(duì)，分析HCV NS3區(qū)的序列變異情況，并與其他地區(qū)HCV1b型NS3區(qū)以及德國(guó)anti-D人群NS3區(qū)序列進(jìn)行序列比對(duì)以及進(jìn)化樹分析。
　

5、　2.分離血細(xì)胞，進(jìn)行基因組DNA抽提，采用型別特異性引物PCR方法檢測(cè)湖北地區(qū)HCV1b型患者相應(yīng)的HLA-A及B類分子等位基因。分析本實(shí)驗(yàn)中人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率，并比較德國(guó)人群與中國(guó)人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率。
　　3.使用生物信息學(xué)軟件分析中國(guó)人群HCV1b型NS3區(qū)HLA-I類分子限制性CD8+T細(xì)胞表位內(nèi)的序列突變是否與相應(yīng)的HLA-I類分子相關(guān)。比較中國(guó)人群的突變情況與德國(guó)人群突變情況

6、。
　　4.使用合成多肽對(duì)表達(dá)相應(yīng)的等位基因的慢性HCV患者的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行HCV特異性增殖以及再刺激后進(jìn)行IFN-γ細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，再使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分泌IFN-γ的細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比值，進(jìn)一步驗(yàn)證CD8+T細(xì)胞表位內(nèi)的選擇性突變對(duì)T細(xì)胞識(shí)別的影響。
　　結(jié)果
　　1．本實(shí)驗(yàn)共獲得1b型HCV NS3區(qū)全長(zhǎng)序列89例。所得序列經(jīng)進(jìn)一步進(jìn)化樹分析確認(rèn)為1b型，且湖北地區(qū)序列與中國(guó)其他地區(qū)1b型序列親緣性

7、近，與日本、東南亞地區(qū)及歐美地區(qū)的1b型親緣性遠(yuǎn)；將本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增獲得的中國(guó)HCV1b型NS3區(qū)與德國(guó)感染同一來源HCV污染的免疫球蛋白人群（anti-D cohort）NS3區(qū)以及德國(guó)散發(fā)感染人群的HCV1b型NS3區(qū)進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)人群序列主要落于兩個(gè)進(jìn)化叢內(nèi)，德國(guó)人群中anti-D cohort NS3區(qū)落于三個(gè)進(jìn)化叢內(nèi)，其他散發(fā)感染的1b型序列未見明顯進(jìn)化叢。在本實(shí)驗(yàn)中89例序列的兩個(gè)進(jìn)化之間，患者性別，年齡，病毒載量以及H

8、LA-I類分子表達(dá)頻率無明顯差異，提示中國(guó)HCV1b型兩個(gè)進(jìn)化叢的產(chǎn)生主要是可能由于不同的兩個(gè)原始感染源所致。
　　2． HLA-A及B類分子分型檢測(cè)結(jié)果顯示：本實(shí)驗(yàn)中人群表達(dá)頻率較高的HLA-A類分子有HLA-A*11（25.77％）、HLA-A*02（28.83%）、HLA-A*24（16.56%）、HLA-A*30（4.91%）和HLA-A*33（9.82%），表達(dá)頻率較高的HLA-B類分子有HLA-B*40(13.25%)

9、、HLA-B*15(15.66%)、HLA-B*13(13.86%)、HLA-B*46(14.46%)以及HLA-B*58(9.64%)。湖北地區(qū)人群與數(shù)據(jù)庫中中國(guó)人群的HLA-A及B類分子基因頻率無明顯差異。將數(shù)據(jù)庫中德國(guó)人群HLA-A以及HLA-B類分子的表達(dá)頻率與中國(guó)人群平均值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)德國(guó)人群與中國(guó)人群的HLA-I類分子表達(dá)頻率有明顯差異：在HLA-A類分子中，中國(guó)人群中表達(dá)頻率較高的HLA-A*11、HLA-A*24和HL

10、A-A*33在德國(guó)人群中表達(dá)頻率較低，而在德國(guó)人群中表達(dá)頻率高的HLA-A*03以及 HLA-A*01在中國(guó)人群中表達(dá)頻率較低。在HLA-B類分子中，中國(guó)人群中表達(dá)頻率較高的HLA-B*40、HLA-B*15、HLA-B*13、HLA-B*51、HLA-B*58和HLA-B*46在德國(guó)人群中表達(dá)頻率較低，而在德國(guó)人群中表達(dá)頻率高的HLA-B*44、HLA-B*07、HLA-B*08以及HLA-B*35在中國(guó)人群中表達(dá)頻率較低。
　

11、　3． HLA-A及HLA-B類分子限制性表位內(nèi)選擇性逃逸突變分析結(jié)果顯示中國(guó)人群慢性HCV1b型感染患者體內(nèi)存在HLA-A及B類分子免疫壓力下的選擇性逃逸突變。在九個(gè)CD8+T細(xì)胞表位內(nèi)相應(yīng)HLA-A及B類分子陽性患者的突變頻率顯著高于陰性患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將本實(shí)驗(yàn)中 HCV1b型序列在HLA-A以及B類分子的免疫壓力下發(fā)生的逃逸突變與德國(guó)人群中的逃逸突變進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組人群HCV1b型在免疫壓力下的選擇性逃逸突變情況不同。

12、4．體外T細(xì)胞功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了新的HLA-A*11表位NS31635-1644，證實(shí)了該表位內(nèi)HLA-A*11壓力下的V1635I選擇性逃逸突變能夠影響CTL應(yīng)答，NS31635-1644表位肽第二位的T1636N以及T1636S突變可影響CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，而1636位其他突變類型則不影響CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。NS31635-16441b型原型所占比例在HLA-B*75陽性患者中顯著高于HLA-B*75陰性患者。
　　結(jié)論<

13、br>　　本研究詳細(xì)探討了中國(guó)地區(qū)HCV1b型的NS3區(qū)序列變異情況，對(duì)中國(guó)地區(qū)HCV1b型序列的演變進(jìn)行了分析，系統(tǒng)比較了中國(guó)不同地區(qū)以及中國(guó)人群與德國(guó)人群HLA-A、B類分子基因頻率之間的差異，進(jìn)行了中國(guó)人群HCV1b型在宿主免疫壓力下逃逸突變的分析，以及體外 T細(xì)胞功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)與德國(guó)人群的 HLA-A、B類分子表達(dá)頻率存在明顯差異，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了中國(guó)HCV1b型可能存在兩個(gè)主要感染源；發(fā)現(xiàn)中國(guó)人群中存在宿主免疫

14、壓力下HCV1b型的逃逸突變，且中國(guó)及德國(guó)人群HCV1b型在免疫壓力下的選擇性逃逸突變不同，提示在不同遺傳背景人群中HCV1b型在宿主免疫壓力下的選擇性逃逸突變不同。我們還發(fā)現(xiàn)了HCV1b型新的HLA-A*11限制性表位，驗(yàn)證了HLA-I類分子免疫壓力下HCV1b型病毒序列的逃逸突變能夠影響CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，且表位肽不同位點(diǎn)的突變或相同位點(diǎn)不同的氨基酸突變對(duì)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的影響各不相同，提示只有特定的氨基酸突變才能夠影響 CTL應(yīng)

15、答。NS31635-16441b型原型所占比例在HLA-B*75陽性患者中顯著高于HLA-B*75陰性患者。提示該位點(diǎn)突變?cè)?HLA-B*75陽性患者中可能有恢復(fù)至原型的趨勢(shì)，推測(cè)HLA-B*75對(duì)HCV1b中國(guó)一致序列感染的患者可能有保護(hù)作用。
　　本研究于國(guó)內(nèi)外首次分析了中國(guó)乃至亞洲地區(qū)人群遺傳背景對(duì)于HCV1b型逃逸宿主免疫應(yīng)答的影響，部分闡述了中國(guó)人群HLA-I類分子參與HCV1b型免疫逃逸的機(jī)制，為后續(xù)基于T細(xì)胞應(yīng)答的H