中國人群移植抗原特異慢粒白血病表位疫苗制備及免疫活性研究.pdf

1、研究背景
　　慢性粒細胞性白血病(CML)是一種造血干細胞慢性克隆增殖性疾病。BCR/ABL融合基因或費城染色體為其特征性的形態(tài)學異常。BCR/ABL融合基因同時也表達于一部分急性淋巴細胞白血病(ALL)的病人中。酪氨酸激酶阻滯劑的出現(xiàn)使得慢性粒細胞性白血病的治療取得了巨大的進展，但是由于微小殘留病變的存在以及耐藥的出現(xiàn)，慢性粒細胞性白血病仍難以治愈。因此，如何清除微小殘留病變成為治療白血病過程中的重要問題。有研究報道，包括疫苗在

2、內(nèi)的免疫療法對CML的治療有一定的療效。來源于P210融合蛋白的多肽在體外可誘導出MHC限制性的T淋巴細胞的增殖。另外，WT1基因也表達于慢性粒細胞性白血病及急性淋巴細胞白血病中，因此，WT1多肽也可誘導出特異性的免疫反應，用來治療CML的微小殘留病變。目前，BCR/ABL及WT1多肽疫苗已取得了巨大的進展，但是，這些疫苗大多只針對以單一HLA表位并大多適用于歐美人群。因此，針對于中國人群HLA表型的多肽疫苗有待于進一步研究。
　

3、　目的
　　通過篩選針對CML多種抗原蛋白的免疫表位，合成一條對應各抗原表位的串聯(lián)核苷酸序列，包裝入慢病毒過表達系統(tǒng)，感染DC細胞，制備成HLA特異性慢性粒細胞性白血病表位疫苗，并在體外對其進行免疫活性研究。為慢性粒細胞性白血病的免疫治療提供了新的方向。
　　方法
　　1、多肽表位的選擇:通過查閱CML表位相關(guān)文獻，從中選取針對CML抗原蛋白的免疫表位，通過SYFPEITHIMHC表型及表位預測系統(tǒng)和MAPPP蛋白酶體

4、降解預測系統(tǒng)對所選表位進行表位肽預測和MAPPP蛋白酶體切割-表位生成預測后，通過重疊區(qū)擴增基因法及PCR技術(shù)合成CML串聯(lián)表位全長基因。
　　2、HLA特異慢粒白血病DC疫苗的制備及鑒定:利用基因工程的相關(guān)方法把目的基因包裝入慢病毒過表達系統(tǒng)。收集正常人外周血單個核細胞(PBMC)，體外誘導DC細胞。重組慢病毒感染DC細胞后制備成HLA特異慢粒白血病疫苗。實時熒光定量方法(qRT-PCR)檢測目的基因在慢病毒感染后的DC細胞中的

5、mRNA水平的表達情況。且在熒光顯微鏡下觀察DC細胞內(nèi)熒光的表達。
　　3、HLA特異慢粒白血病疫苗的體外免疫活性鑒定:免疫磁珠方法分選PBMC中的CD3+T淋巴細胞，流式細胞學方法檢測所分選的T淋巴細胞的純度。DC疫苗與CD3+T淋巴細胞共培養(yǎng)后激活其成為CTL細胞，CTL細胞與靶細胞共培養(yǎng)，乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗測定T細胞的殺傷效率;ELISPOT方法檢測CTL細胞IFN-γ的分泌。
　　結(jié)果
　　1、通過S

6、YFPEITHI和MAPPP預測及查閱相關(guān)文獻，選取50個免疫表位，這些免疫表位包含多種不同HLA表型的BCR/ABL及WT1抗原。
　　2、成功合成CML串聯(lián)表位全長基因，并且成功包裝入慢病毒過表達系統(tǒng)。在體外成功誘導出DC細胞，并將慢病毒感染DC細胞，制備成HLA特異慢粒細胞DC疫苗。PCR證實目的基因在DC細胞中成功表達。熒光顯微鏡下可觀察到病毒感染后的DC細胞中有熒光表達。
　　3、LDH釋放試驗證實實驗組T細胞殺傷