中國(guó)人群優(yōu)勢(shì)MHC限制性HIV-1多表位疫苗研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染已造成世界范圍內(nèi)數(shù)千萬(wàn)人致病甚至死亡，嚴(yán)重威脅著人類健康。發(fā)展能預(yù)防和阻斷HIV-1感染的疫苗一直是HIV-1研究的核心科學(xué)問(wèn)題。然而，HIV-1極易發(fā)生突變并可通過(guò)多種方式逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng);同時(shí)，HIV-1亞型眾多，不同地域的人群感染的HIV-1亞型具有不同的流行特點(diǎn)，不同人種的HLA限制性也相差甚遠(yuǎn)，這些因素都使得HIV-1疫苗的研發(fā)困難重重。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開展了大量HIV-1疫苗相關(guān)研究并

2、取得一定的進(jìn)展，但仍未研發(fā)出一種安全、有效的疫苗。因此，仍然需要采取不同的發(fā)展策略進(jìn)行HIV-1疫苗的深入研究。
　　本研究針對(duì)中國(guó)大陸地區(qū)病毒亞型的流行特點(diǎn)以及中國(guó)人群HLA限制性特征，開展以表位為基礎(chǔ)的疫苗設(shè)計(jì)研究，著眼于設(shè)計(jì)發(fā)展一種中國(guó)人群適用的HIV-1候選疫苗。本研究擬通過(guò)生物信息分析技術(shù)，篩選在HIV-1中國(guó)主要流行病毒株中序列高度保守而且符合中國(guó)人群優(yōu)勢(shì)MHC限制性的表位;進(jìn)行多表位疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)和構(gòu)建;利用多個(gè)不同

3、品系的小鼠模型進(jìn)行疫苗免疫效果評(píng)價(jià);并結(jié)合HIV-1臨床感染者的細(xì)胞標(biāo)本評(píng)價(jià)HIV-1多表位疫苗的人群適用性及在HIV-1預(yù)防和治療方面的應(yīng)用潛力。
　　1.具有中國(guó)人MHC限制性特征的HIV-1表位篩選及多表位疫苗設(shè)計(jì)
　　(1)候選表位的篩選及鑒定:為了篩選獲得理想的表位用于疫苗設(shè)計(jì)，通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研及數(shù)據(jù)庫(kù)分析，篩選符合下列要求的表位:1）、表位位于env、gag及pol基因編碼的蛋白上;2）、表位在中國(guó)主要流行株（Chi

4、naB、CRF01_ AE、CRF07_ BC及CRF08 BC）中高度保守;3）、表位的MHC限制性與中國(guó)人群優(yōu)勢(shì)分布的HLA基因型一致。利用軟件分析表位的MHC限制性及序列保守性，最終獲得9個(gè)符合條件的CTL表位，分別位于Gag（6個(gè)）、Env（2個(gè)）及Pol（1個(gè)）蛋白上，并選取了一段位于Env蛋白上的由36個(gè)氨基酸組成的Th表位富集區(qū)。(2)多表位核酸疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)、構(gòu)建及鑒定:為了獲得多表位疫苗的最優(yōu)化設(shè)計(jì)，以上述篩選獲得的九

5、個(gè)CTL表位及一段Th表位富集區(qū)為基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)整表位的串聯(lián)順序和呈現(xiàn)方式以及選用不同類型的表位間連接子，嘗試多種多表位設(shè)計(jì)組合，并選擇3個(gè)具有代表性的疫苗設(shè)計(jì)組合(MEG1、MEG2、MEG3)，構(gòu)建相應(yīng)的真核表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)生物軟件分析三種設(shè)計(jì)的序列結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測(cè)三種質(zhì)粒的體外表達(dá)能力，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)三種質(zhì)粒的體內(nèi)免疫原性。結(jié)果表明，pJW4303-MEG1與pJW4303-MEG2序列特征相似，均在體外正常表達(dá)并在體內(nèi)誘

6、導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng);而pJW4303-MEG3不但其預(yù)測(cè)分析的結(jié)構(gòu)特征與前兩者顯著不同，而且體外轉(zhuǎn)染結(jié)果及體內(nèi)免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。上述結(jié)果說(shuō)明連接子的種類是多表位疫苗設(shè)計(jì)的主要影響因素之一，以柔性連接子“GGGS”的效果更優(yōu)。
　　(3)多表位核酸疫苗pJW4303-MEG1的免疫原性分析及保護(hù)效果評(píng)價(jià):為了評(píng)價(jià)核酸疫苗pJW4303-MEG1的免疫效果，以BALB/c小鼠為對(duì)象進(jìn)行核酸免疫，評(píng)價(jià)該候選疫苗誘導(dǎo)的單肽特異性免

7、疫反應(yīng)及免疫記憶。結(jié)果表明該質(zhì)粒能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)所有H-2d限制性表位的單肽免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)的長(zhǎng)期免疫記憶能維持至少一年。進(jìn)一步以重組病毒rTTV-lucgag進(jìn)行小鼠攻毒，通過(guò)檢測(cè)小鼠體內(nèi)病毒嗜性組織的熒光素酶活性強(qiáng)度評(píng)價(jià)pJW4303-MEG1的免疫保護(hù)效果，結(jié)果表明免疫組小鼠體內(nèi)的病毒含量與對(duì)照組相比雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但病毒含量有明顯的下降趨勢(shì)。上述結(jié)果說(shuō)明MEG1多表位疫苗設(shè)計(jì)策略為優(yōu)化的疫苗設(shè)計(jì)方案，對(duì)應(yīng)的核酸疫苗pJW

8、4303-MEG1具有良好的免疫原性。
　　2.HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1在BALB/c小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)評(píng)價(jià)
　　(1)多表位蛋白疫苗MEP1的制備及鑒定:為了制備獲得高純度的多表位候選蛋白疫苗MEP1，首先將大腸桿菌密碼子優(yōu)化的多表位序列插入到原核表達(dá)載體pQE30上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pE30-MEG1并酶切鑒定;小量誘導(dǎo)摸索最適誘導(dǎo)條件并鑒定，目的蛋白MEP1主要以包涵體形式表達(dá);大量誘導(dǎo)制備獲得含有MEP1蛋白的包

9、涵體，8M脲溶解后利用Ni+柱親和層析法純化并進(jìn)一步復(fù)性濃縮;利用SDS-PAGE及WB檢測(cè)蛋白的純度及特異性，最終成功制備高純度的目的蛋白MEP1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　(2)蛋白MEP1在BALB/c雌性小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)特征評(píng)價(jià):為了評(píng)價(jià)重組蛋白MEP1誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)水平和免疫保護(hù)效果，以BALB/c雌性小鼠為對(duì)象，三次免疫后檢測(cè)免疫反應(yīng)并開展攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。ELISA結(jié)果表明MEP1能誘導(dǎo)高水平的特異性抗體;ELISPOT結(jié)果

10、表明MEP1與鋁鹽佐劑聯(lián)合免疫能有效誘導(dǎo)Th1/Th2平衡的細(xì)胞免疫應(yīng)答及單肽特異性免疫反應(yīng);攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白MEP1誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有一定的保護(hù)效果，能有效降低小鼠卵巢中的模式病毒rTTV-lucgag的含量。另外，該重組蛋白可快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，小鼠單次免疫后10天即可產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　(3)小鼠性別對(duì)重組蛋白MEP1誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的影響分析:為了評(píng)價(jià)性別因素對(duì)蛋白MEP1誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的影響。以BAL

11、B/c雄性小鼠為對(duì)象，進(jìn)行蛋白免疫并進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，蛋白MEP1在雄性小鼠體內(nèi)也能有效誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫產(chǎn)生。與雌性小鼠的免疫應(yīng)答水平相比，雄性小鼠產(chǎn)生的抗體滴度和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答水平略低，Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答水平則與雌性小鼠相當(dāng)。蛋白在雄性小鼠體內(nèi)同樣具有抗病毒rTTV-lucgag效果，說(shuō)明重組蛋白MEP1對(duì)不同性別的小鼠均可誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
　　3.HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1誘導(dǎo)的人MHC限制

12、性免疫反應(yīng)特征研究
　　(1)蛋白MEP1在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答特征研究:為了驗(yàn)證蛋白MEP1誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答與表位MHC限制性之間的相關(guān)性，以A2/DR1及A11/DR1轉(zhuǎn)基因小鼠為對(duì)象并以基因本底C57BL/6小鼠為對(duì)照，蛋白聯(lián)合鋁鹽佐劑免疫三次后進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)。ELISPOT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果均表明蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答與MHC限制性有顯著關(guān)聯(lián)，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)度及單肽特異性反應(yīng)廣度均顯著優(yōu)于C57BL/

13、6對(duì)照小鼠。進(jìn)一步以A2/DR1小鼠為對(duì)象檢測(cè)蛋白免疫對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的影響，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明重組蛋白能改變機(jī)體的免疫細(xì)胞構(gòu)成比并上調(diào)APC細(xì)胞表面的MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　(2)蛋白MEP1對(duì)HIV-1感染者PBMCs的體外刺激效果評(píng)價(jià):為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白MEP1誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與MHC限制性的相關(guān)性，并探索該蛋白在中國(guó)人群中的適用性，以HIV-1確診感染者的PBMCs樣本為對(duì)象，進(jìn)行蛋白MEP

14、1體外刺激。ELISPOT結(jié)果顯示HIV-1感染者的PBMCs在蛋白刺激后能顯著分泌細(xì)胞因子IFN-γ及IL-2，而正常人的PBMCs在蛋白刺激后則表現(xiàn)為陰性反應(yīng)。后續(xù)分析結(jié)果表明，重組蛋白MEP1作用于不同MHC限制性人群和不同治療階段的病人，均能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，預(yù)示該多表位蛋白疫苗在中國(guó)人群中適應(yīng)性好。
　　4.結(jié)論
　　本研究篩選獲得了符合中國(guó)人群優(yōu)勢(shì)MHC限制性并在HIV-1中國(guó)主要流行株中高度保守的9個(gè)CTL表位

15、和一段Th表位富集區(qū)。以此為基礎(chǔ)開展HIV-1多表位候選疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，表位間連接子是多表位疫苗設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵影響因素之一。本研究設(shè)計(jì)和發(fā)展了一種HIV-1候選多表位蛋白疫苗MEP1，該蛋白在小鼠模型中表現(xiàn)出良好的免疫原性和免疫保護(hù)性，并且能有效刺激HIV-1感染者的PBMCs產(chǎn)生免疫反應(yīng)。該蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與MHC限制性密切相關(guān)并且在中國(guó)人群中適用性好。本研究不僅為研發(fā)安全有效的HIV-1疫苗提供了新思路，同時(shí)也建立了一