環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法快速和實(shí)時檢測金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒和院內(nèi)感染的一種主要病原菌。因此，對金黃色葡萄球菌的檢測技術(shù)的開發(fā)具有較高的應(yīng)用價值。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增方法(LAMP)擴(kuò)增特異性核酸序列，具有高特異性、高靈敏性、簡便、快速和低成本的特點(diǎn)，已在諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本文選擇了金黃色葡萄球菌穩(wěn)定攜帶的特異基因——凝固酶編碼基因coa作為LAMP方法檢測的靶序列，并針對coa基因使用Primer_Premier_v5軟件通過與GeneBank已公布的93條同源序列

2、的比對結(jié)果設(shè)計了特異性LAMP引物。引物序列分別為：F3，5'-GCTGGCCCAACACAAAACAAG-3'；B3，5'-GTCGCAGTACCATCTGCATG-3'；FIP，5'-CGCTTGGCTTCTTGTATGTCGGGCGCATATAACGTAACAACACATG-3'；BIP，5'-CAACGTACAACACATGCAAATGGGCGTTTGTTTCGCTTGGC-3'；LF，5'-GGTCAAGTATCATACGG-

3、3'；LB，5'-CATATGGCGCTCGCCCGACAC-3'。
　　 本文對LAMP用于檢測金黃色葡萄球菌的技術(shù)方法、檢測效果和實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了研究：確定了金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)方法、菌體計數(shù)方法、染色體DNA提取，并制備了菌裂解液和DNA提取液，分別作為LAMP檢測的模板。通過對反應(yīng)體系各成分濃度的摸索確定最佳反應(yīng)體系。通過對金黃色葡萄球菌的4株標(biāo)準(zhǔn)菌株、7株分離株和33株非金葡菌菌株的檢測證明本方法具有良好的特異性。本實(shí)驗(yàn)

4、獲得的檢測低限為5.6×101CFU/管，其靈敏度比普通PCR方法至少提高了100倍?；蚺c實(shí)時熒光PCR儀相結(jié)合，通過檢測已知模板濃度的10倍梯度稀釋液并對其時間閾值做線性回歸，得線性方程y=-1.8721n(x)+54.5 andR2=0.9887，再通過實(shí)際樣品的時間閾值實(shí)現(xiàn)半定量檢測，實(shí)時LAMP的檢測限更是達(dá)到了1.4 CFU/管。本方法將快速細(xì)菌培養(yǎng)、簡化的三步法基因組抽提和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增結(jié)合起來，可以短暫增菌、微波裂解細(xì)菌釋