實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)檢測(cè)牛乳中金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表。一方面金黃繁殖，可產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒，其是人類(lèi)的一種重要的食源性病原菌。許多食物，特別是肉、蛋、奶和它們制成的食品等被該菌污染的概率較大。最近幾年，越來(lái)越多的金黃色葡萄球菌食物中毒已經(jīng)成為世界性的健康問(wèn)題。目前，對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不夠靈敏，并且不能對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而建立一種快速、敏感的金黃色葡萄球菌的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法是必要的。<

2、br>　　本研究采用的實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的改良;其是在LAMP體系中加入了熒光染料SYBR GreenⅠ，SYBR GreenⅠ可以結(jié)合到雙鏈DNA核酸上，結(jié)合后會(huì)發(fā)出比原來(lái)增強(qiáng)數(shù)千倍的熒光信號(hào)，將此LAMP反應(yīng)體系放入實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀器進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)儀的相應(yīng)軟件可觀察反應(yīng)進(jìn)程。該方法可隨時(shí)終止試驗(yàn)，控制反應(yīng)進(jìn)程。
　　基于GenBank中金黃色葡萄球菌的nuc基因序列，本研究利用在線引物設(shè)計(jì)軟

3、件Primer V4根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并選擇與金黃色葡萄球菌的nuc基因相匹配的特異性引物。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中引物的添加量及內(nèi)外引物的比例、Mg2+的添加量、dNTPs的濃度、反應(yīng)溫度、Bst DNA聚合酶和熒光染料SYBR GreenⅠ的稀釋倍數(shù)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立反應(yīng)體系如下:
　　FIP和BIP各1.6μM，F(xiàn)3和B3各0.4μM，2mM MgSO4，0.35mM dNTPs，2.5μL10×Bst DNA聚合酶緩沖液，

4、12U的Bst DNA聚合酶，0.5μL DNA模板，0.5μL1∶350稀釋的SYBRGreenⅠ熒光染料，6.5μL滅菌蒸餾水。設(shè)定反應(yīng)溫度為61℃，反應(yīng)時(shí)間為90min，利用實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀并結(jié)合電腦軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，根據(jù)反應(yīng)進(jìn)程可隨時(shí)終止反應(yīng)。
　　本研究對(duì)8株金黃色葡萄球菌及16株其他食源性致病菌共24株菌株進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明只有8株金黃色葡萄球菌菌株的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其他16株食源性致病菌菌株檢測(cè)結(jié)果均為