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1、新一代DNA測(cè)序技術(shù)經(jīng)過近十年的發(fā)展,以其高通量、快速和低成本等特點(diǎn),已經(jīng)成為研究和認(rèn)識(shí)生命的一項(xiàng)重要手段,并正在改變生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究模式,讓我們可以在更深的層次探索、研究和理解生命。但是,盡管新一代DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了極大的發(fā)展,它依然存在著測(cè)序長度較短、效率較低和精度可待提升等不足。研究中我們發(fā)現(xiàn),通過改變測(cè)序方案中的信息組合方式可以很好地改善這些不足,為此我們通過設(shè)計(jì)測(cè)序過程中的信息組合方式,提出了一種雙堿基組合熒光延伸的
2、測(cè)序方案,并利用這一方案,創(chuàng)新地設(shè)計(jì)了基于高通量DNA測(cè)序的STR分型方法。本論文圍繞這一新的測(cè)序技術(shù),完成了如下的一些探索性工作:
1.雙堿基組合熒光延伸測(cè)序方法
結(jié)合現(xiàn)有的新一代DNA測(cè)序的基本原理,提出了一種基于延伸測(cè)序的雙堿基組合熒光測(cè)序的方法。新方法根據(jù)堿基的不同兩兩組合方式,在兩個(gè)熒光通道下對(duì)模版序列進(jìn)行三輪不同的編碼測(cè)序,最終根據(jù)不同輪次序列信息中的編碼結(jié)果推導(dǎo)出模版序列。
運(yùn)用M
3、atlab軟件,對(duì)雙堿基組合熒光延伸測(cè)序方法進(jìn)行了模擬。模擬了測(cè)序?qū)嶒?yàn)中用不同的熒光組合對(duì)模版鏈編碼的過程,實(shí)現(xiàn)了對(duì)一條任意給定序列的模擬編碼和解碼,并且改進(jìn)了解碼算法。模擬研究證明,任意兩組雙熒光核苷酸組合的編碼序列即可以反推出原始序列。最后,對(duì)整個(gè)測(cè)序方法建立了相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型,并分析了它的系統(tǒng)誤差。
2.基于新一代測(cè)序的STR分型方法
分析了DNA指紋技術(shù)中經(jīng)典的STR分型技術(shù)的檢測(cè)原理,基于第二代DNA
4、延伸測(cè)序技術(shù),提出了新的可對(duì)大量STR樣本進(jìn)行并行分型和測(cè)序的新方法。通過對(duì)STR檢測(cè)的模式進(jìn)行了調(diào)整,從測(cè)序文庫制備、延伸測(cè)序檢測(cè)和圖像數(shù)據(jù)分析等三個(gè)環(huán)節(jié),提出了具體的實(shí)現(xiàn)方案和操作步驟。
根據(jù)新STR檢測(cè)原理,我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)通過模板逐次變性的方法,對(duì)自行設(shè)計(jì)合成的專用核苷酸單體試劑dCTP-diol-NH2進(jìn)行了延伸的檢測(cè)實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)了該堿基的延伸效率和特異性。由于變性的效率以及延伸非同步性的問題,所得到的熒光信號(hào)質(zhì)量還
5、不能滿足STR延伸檢測(cè)的要求,需要對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和試劑進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)。在實(shí)驗(yàn)過程中,我們發(fā)現(xiàn)了模板序列中的一個(gè)雙堿基突變位點(diǎn)。
3.基于新一代高通量測(cè)序的熒光成像自動(dòng)曝光方法的優(yōu)化
在新一代DNA測(cè)序儀中,需要對(duì)數(shù)萬幅高分辨率熒光圖像進(jìn)行快速、高靈敏度地檢測(cè),這就需要儀器能夠?qū)崿F(xiàn)快速曝光的自動(dòng)化。在測(cè)序過程中往往存在一些熒光雜質(zhì),會(huì)影響自動(dòng)曝光結(jié)果,從而嚴(yán)重降低測(cè)序的質(zhì)量和精度。我們分析了雜質(zhì)成像特征以及普通光
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