25290.新一代高通量dna測序的新方法研究

1、東南大學博士學位論文新一代高通量DNA測序的新方法研究姓名：李燕強申請學位級別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學工程指導教師：陸祖宏20101103中文摘要利用該方法對一條固定在芯片中DNA序列進行了測定，結(jié)果與原始序列一致，因此它可以應(yīng)用于固定有大量模板DNA芯片上，該方法具有通量高、測序能力強、成本低和準確性高等特點。2內(nèi)切酶V介導的連接測序方法基于連接反應(yīng)的測序(如SOLID系統(tǒng))是先把通用引物與待測DNA兩端的接頭序列互補結(jié)合；然后在連接酶的

2、介導下，將一個帶有熒光標記8bp長的核酸探針(fluorescemlylabeledoctamers)連接到引物3’末端；反應(yīng)完成之后，通過熒光圖像的分析即可鑒定出熒光標簽所對應(yīng)的測定堿基；然后通過切斷第五堿基和第六堿基之間的連接，去掉熒光標簽。如此反復，就可以獲得每間隔四個堿基的第五位堿基的確切信息。提出了使用不同長度的引物(1或者1)或者在不同位點(比如第2位堿基)標記熒光的8bp核酸探針片段來實現(xiàn)連接測序，以獲得整條模板片段的完整

3、序列信息。所提出的探針熒光切割方法不同在于：反應(yīng)中采用的切割反應(yīng)是在內(nèi)切酶V(也稱為脫氧次黃核苷3’內(nèi)切酶)的作用下進行的。核酸內(nèi)切酶V是在Ecoli中發(fā)現(xiàn)的一種DNA修復酶。它識別DNA中的脫氧次黃核苷，即脫氧腺苷的去氨基產(chǎn)物。核酸內(nèi)切酶V可以在距錯配脫氧次黃苷第二個或第三個磷酸二酯鍵的3’未端進行切割，切割第二個磷酸二酯鍵的效率是95％，第三個磷酸二酯鍵的效率是5％，能夠產(chǎn)生一個3’羥基、5’磷酸的切口。利用該切口，進行后續(xù)的雜交連

4、接反應(yīng)，從而實現(xiàn)多個堿基的測定。通過引入硫代修飾的方法，來抑制次要切割位點，以達到唯一切割位點的目的。該方案已得到實驗結(jié)果的驗證，實現(xiàn)了25bp序列的正確讀取。3連接微測序方法在SNP分型上的應(yīng)用之前本實驗室曾經(jīng)提出一種通過雙色熒光雜交的方法在DNA芯片上檢測SNP，具有準確性高且操作簡便等特點。但該方法的不足之處為每檢測一個位點就需要一對熒光標記的探針。分析樣本數(shù)目不是很多時(如數(shù)百個)，每個位點熒光探針的費用平攤到每個樣本的成本就會