轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β-,1-和胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ及其協(xié)同作用對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和物質(zhì)生活水平的提高,人們對(duì)容貌美的要求越來越高,更加注重榮光煥發(fā)的“面子”工程。而早期的面部皺紋及微小缺損等治療一直是困擾人們的一個(gè)難題,也是美容外科領(lǐng)域所面臨的一個(gè)新挑戰(zhàn)。目前,在美容整形項(xiàng)目中,非手術(shù)性治療迅速增長(zhǎng),占據(jù)的比例已經(jīng)超過了80％。其中,皮膚充填劑注射是非手術(shù)性美容治療的一個(gè)重要組成項(xiàng)目,也是治療早期靜態(tài)性皺紋及面部微小凹陷的首選方法。早期的皮膚充填劑有很多種,大體可以分為以下3

2、類:(1)人工合成材料如:硅膠、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺水凝膠等。(2)生物材料如:膠原、透明質(zhì)酸等。(3)自體材料如:自體脂肪或自體膠體等。然而,長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐表明這些材料均或多或少地存在一定程度的并發(fā)癥,其中一些材料因并發(fā)癥較多且較嚴(yán)重已陸續(xù)被一些國(guó)家禁止使用。作為理想的皮膚充填劑必須符合下列特征:①組織相容性好；②無過敏反應(yīng)；③不致癌,不致畸；④作用持久,效果可靠；⑤獲取容易,成本低廉。目前,采用體外培養(yǎng)的自體皮膚成纖維細(xì)胞(

3、human skin fibroblast,HSF)注射移植為解決這一難題提供了一個(gè)全新的思路。因?yàn)檫@種方法注入的成纖維細(xì)胞是自體細(xì)胞,所以不存在免疫排斥反應(yīng)；其次,注入的成纖維細(xì)胞可以在體內(nèi)存活并增殖,不斷地產(chǎn)生膠原蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)成分,從而維持持久的填充效果。第三、皮膚標(biāo)本的獲取較為容易,一般只需在患者耳后較隱蔽部位取約3mm2大小皮膚,即可在體外進(jìn)行分離培養(yǎng)。然而,培養(yǎng)的自體細(xì)胞在注射之前需要達(dá)到一定的濃度才能移植。如何在體外快速

4、擴(kuò)增自體成纖維細(xì)胞至注射所需濃度,是目前這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于臨床的主要瓶頸。
　　 生長(zhǎng)因子是一類具有誘導(dǎo)和刺激細(xì)胞增殖與分化,維持細(xì)胞存活等生物學(xué)效應(yīng)的蛋白類物質(zhì),對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖,組織或器官修復(fù)和再生都具有重要的促進(jìn)作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)被認(rèn)為是最重要的致纖維化細(xì)胞因子,其在創(chuàng)面愈合和組織纖維化過程中起重要的調(diào)控作用,表達(dá)水平與瘢痕的增生程度成正相關(guān)。主要

5、作用為刺激成纖維細(xì)胞中葡萄糖與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解的進(jìn)行,導(dǎo)致合成顯著增加,包括膠原蛋白、粘連蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)成分。胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(insulin-like growth factor-I,IGF-I),是一種與胰島素具有很大同源性的蛋白質(zhì)激素,能促進(jìn)成纖維細(xì)胞快速進(jìn)入細(xì)胞周期,刺激細(xì)胞分化,明顯提高細(xì)胞外基質(zhì)合成。本實(shí)驗(yàn)選用以往研究證實(shí)的在創(chuàng)傷后瘢痕愈合過程中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子即轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及胰島素樣生

6、長(zhǎng)因子-I(IGF-I),作用于體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞,觀察各生長(zhǎng)因子單獨(dú)應(yīng)用與聯(lián)合在一起應(yīng)用對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響,探索皮膚成纖維細(xì)胞體外快速擴(kuò)增的新方法,以期縮短臨床治療時(shí)間和治療周期,使自體皮膚成纖維細(xì)胞注射移植具有更切實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法:
　　 1、皮膚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)采用胰酶消化法和組織塊貼壁法相結(jié)合的方法進(jìn)行原代培養(yǎng)。
　　 2、皮膚成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)采用差速貼壁法對(duì)其進(jìn)行純

7、化,并在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 3、加入生長(zhǎng)因子并檢測(cè)細(xì)胞增殖情況取生長(zhǎng)狀況良好的第3代皮膚成纖維細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板,加入含不同濃度TGF-β1(0.1、1.0、10.0、50.0μg/L)、IGF-I(1.0、10.0、50.0、100.0μg/L)的完全培養(yǎng)液作用于細(xì)胞,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔和陰性對(duì)照組,分別作用3d、6d和9d,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,確定各生長(zhǎng)因子最佳效應(yīng)濃度。同法設(shè)4個(gè)組,每組6個(gè)復(fù)

8、孔,分別為:陰性對(duì)照組、TGF-β1最佳效應(yīng)濃度組、IGF-I最佳效應(yīng)濃度組、TGF-β1與IGF-I最佳效應(yīng)濃度聯(lián)合應(yīng)用組,作用3d、6d和9d,采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、原代培養(yǎng)4d,倒置相差顯微鏡下觀察見少量細(xì)胞從組織塊邊緣爬出,聚集成一團(tuán),呈圓形或類圓形,細(xì)胞器少,為低分化細(xì)胞；7d后細(xì)胞逐漸增多,呈梭形散在分布,胞漿周圍可見2～3個(gè)偽足；傳至第3代時(shí)細(xì)胞已呈明顯長(zhǎng)梭扁平狀,胞核

9、比例增大,細(xì)胞器較為明顯,為高分化狀態(tài)。
　　 2、TGF-β1對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響作用6d和9d,各濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；10.0μg/L的TGF-β1與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05),此即為最佳效應(yīng)濃度。其他各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3、IGF-I對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響作用6d和9d,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

10、05)。作用9d,50.0μg/L的IGF-I與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),此即為最佳效應(yīng)濃度,其他各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4、TGF-β1與IGF-I最佳效應(yīng)濃度聯(lián)合應(yīng)用對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響10.0μg/L TGF-β1與50.0μg/L IGF-I聯(lián)合作用9d可顯著促進(jìn)細(xì)胞增值,與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):10.0μg/L TGF-β1與50.0μg/L