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文檔簡介
1、目的:通過觀察轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)對支氣管哮喘患者肺成纖維細胞增殖和分泌的影響,探討二者在支氣管哮喘氣道重塑中的作用和關(guān)系。
方法:采用組織塊貼壁法和酶消化法,分離和原代培養(yǎng)支氣管哮喘患者肺成纖維細胞,免疫熒光法進行鑒定。0μg/L TGF-β1濃度(對照組)、1μg/L TGF-β1濃度(A組)、5μg/L TGF-β1濃度(B組)、10μg/L TGF-β1濃度(C組)分別作用肺成纖維細胞48h,MTT法測
2、定成纖維細胞增殖水平,Westrn blot檢測α-SMA蛋白的表達,RT-PCR法分別測定在以上不同TGF-β1濃度作用48h下,肺成纖維細胞Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)和Ⅲ型膠原(CollagenⅢ)的mRNA表達水平。
結(jié)果:組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)出了肺成纖維細胞,酶消化法未能成功。組織塊接種第6d時有少量細胞于其周圍爬出,呈長梭形或者三角形,約25d細胞鋪滿瓶底,用自然純化和差速貼壁法純化細胞,胰酶消化法傳代培養(yǎng)
3、,并且可以進行凍存與復(fù)蘇。免疫熒光法鑒定原代培養(yǎng)出的細胞,成纖維細胞因表達波形蛋白而染成綠色,證明該實驗研究的細胞為肺成纖維細胞。MTT法檢測結(jié)果示:不同濃度的TGF-β1均可刺激哮喘患者肺成纖維細胞增殖,呈濃度依賴性(P<0.05)。Weternblot結(jié)果顯示:不同濃度的TGF-β1作用下,成纖維細胞可表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA),其表達水平與TGF-β1呈明顯的濃度依賴關(guān)系(P<0.05)。RT-PCR法檢測結(jié)果示:在不同
4、濃度的TGF-β1誘導下,成纖維細胞CollagenⅠ mRNA和CollagenⅢ mRNA的表達水平表達上調(diào),均隨著TGF-β1的濃度增高而增高,呈濃度依賴性(P<0.05)。
結(jié)論:組織塊貼壁法是一種較為可靠的肺成纖維細胞分離和原代培養(yǎng)方法。在支氣管哮喘發(fā)病機制中,TGF-β1可促進肺成纖維細胞的增殖,誘導其向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化而被激活,合成和分泌CollagenⅠ和CollagenⅢ,從而引起支氣管哮喘患者氣道粘膜下
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