polι對非小細胞肺癌細胞放、化療敏感性的影響.pdf

1、背景及目的：Polι基因編碼區(qū)含有2147bp,整個基因有5個保守模序。其編碼產物DNA聚合酶ι(Polι)由715個氨基酸殘基組成,是目前發(fā)現(xiàn)的保真性最低的Y家族DNA聚合酶,也是參與跨損傷合成的主要DNA聚合酶成員之一。本實驗通過研究Polι基因對非小細胞肺癌細胞H1299的生長、增殖和放化、療敏感性的影響,為Polι基因成為肺癌治療的新基因靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法：本研究通過構建 Polι基因過表達載體 pcDNA-Po

2、lι、Polι基因干擾載體shRNA-Polι及空載體shRNA-NC,并設pcDNA3.1載體組做對照,經脂質體介導轉染非小細胞肺癌 H1299細胞,(1)用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和 Western blot方法檢測過表達、沉默Polι基因對肺癌H1299細胞Polι基因mRNA和蛋白表達的影響;(2)MTT法檢測各組吸光度值,計算對照組(未轉染)和各轉染組細胞的細胞存活率;(3)MTT法測定轉染shRNA-Polι

3、和shRNA-NC的H1299細胞經不同濃度順鉑作用后的細胞存活率;(4)用10μg/ml的順鉑處理各組轉染后的H1299細胞24h,采用MTT法檢測Polι對H1299鉑類藥物耐受性的影響;(5)采用不同劑量(0、2、4、6、8和10Gy)的60Coγ射線照射各組轉染后的H1299細胞,通過細胞集落形成實驗測定Polι對H1299放射敏感性的影響,并利用―多靶單擊‖數(shù)學模型((S=1-(1-e-D/D0)N))進行曲線擬合,獲得細胞存

4、活曲線。
　　結果：(1)RT-PCR和Western blot結果顯示,轉染pcDNA-Polι的細胞株Polι基因的mRNA和蛋白表達水平較其對照組(pcDNA3.1)增高(P<0.05);轉染shRNA-Polι的細胞株Polι基因的mRNA和蛋白表達水平較其對照組(shRNA-NC)降低(P<0.05);(2)MTT法顯示,Polι基因過表達(pcDNA-Polι)的細胞株細胞增殖率高于其對照組(pcDNA3.1)(P<0

5、.05),而Polι基因下調表達(shRNA-Polι)的細胞株細胞增殖率低于其對照組(P<0.05);(3)隨藥物濃度的增高,較對照組及shRNA-NC轉染組的細胞,shRNA-Polι轉染組細胞的相對存活率降低(P<0.05);(4)Polι過表達的細胞株相對其對照組(pcDNA3.1載體轉染的細胞)對順鉑的耐受性增加(P<0.05),而Polι低表達的細胞株相對其對照組(shRNA-NC載體轉染的細胞)對順鉑的敏感性增加(P<0.

6、05);(5)shRNA-Polι轉染組與對照組(shRNA-NC轉染組)相比,其克隆形成能力明顯受到抑制(P<0.05);pcDNA-Polι轉染組與對照組(pcDNA3.1轉染組)相比,其克隆形成能力明顯增強(P<0.05);(6)shRNA-Polι轉染組的平均致死量(D0)、Dq、N、SF2值(分別為2.266,0.1533,1.070和0.4352)均較其對照組(shRNA-NC轉染組)(分別為3.149,0.3001,1.1

7、0和0.5640)降低(P<0.05),pcDNA-Polι轉染組的平均致死量(D0)、Dq、N、SF2值(分別為3.702,2.064,1.746和0.7825)均較其對照組(pcDNA3.1轉染組)(分別為2.97,0.4382,1.159和0.5625)增高(P<0.05)。
　　結論：Polι過表達可促進H1299增殖,增加該細胞對順鉑和放射線的抵抗性;抑制Polι表達可減慢H1299增殖,增加該細胞對順鉑和放射線的敏感性