血小板MHCI類抗原分子介導(dǎo)CD61特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia, ITP）一種獲得性自身免疫性疾病，以免疫因素介導(dǎo)的血小板減少為特征，是臨床最常見的出血性疾病。該病可能的發(fā)病機(jī)制包括自身反應(yīng)性抗體和/或細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的血小板破壞增多以及巨核細(xì)胞成熟障礙所致的血小板生成減少。近年來，對(duì)ITP發(fā)病機(jī)制的研究取得一系列新進(jìn)展，T細(xì)胞亞群功能異常和細(xì)胞因子比例失調(diào)在疾病發(fā)病

2、過程中的作用一直是研究的熱點(diǎn)問題。近年來，有學(xué)者提出人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen， HLA)基因位點(diǎn)突變與ITP發(fā)病過程存在一定聯(lián)系，亦有關(guān)于MHCⅠ類抗原介導(dǎo)CTL免疫耐受的相關(guān)報(bào)道。在疾病的治療方面，對(duì)血小板輸注的臨床意義仍存在爭(zhēng)議，臨床研究報(bào)道提示血小板輸注安全有效，但缺乏理論依據(jù)支持，國(guó)際工作組最新共識(shí)僅將血小板輸注作為緊急治療措施推薦。因此，利用新型ITP小鼠模型對(duì)CD61特異性CTL在ITP

3、發(fā)病過程中的作用進(jìn)一步研究并探討血小板MHCⅠ類抗原分子對(duì)其免疫耐受的誘導(dǎo)作用，對(duì)揭示ITP的發(fā)病過程及尋求安全有效的治療方案以指導(dǎo)臨床治療均具有重要意義。
　　 研究目的：通過使用三種不同類型血小板免疫BALB/cCD61基因敲除(knockout． KO)小鼠并檢測(cè)被免疫小鼠血清中抗體水平，比較近血小板表面糖蛋白(Glycoprotein， GP) GPIIIa（即CD61）分子與MHCI類抗原分子所誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的異同；

4、利用新型ITP小鼠模型，探索CD61特異性CTL在ITP發(fā)病過程中可能的作用途徑，及MHCI類抗原分子與CD61特異性CTL間的相互作用；研究血小板MHCI類抗原分子在ITP治療中的意義并為臨床應(yīng)用血小板輸注提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1．研究對(duì)象：使用8-12周的BALB/c(H-2d)健康小鼠作為空白對(duì)照，使用8-12周的BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2b)及C57BL/6CD61KO小

5、鼠作為血小板供體；使用8-12周BALB/cCD61基因敲除小鼠作為血小板輸注受體及脾細(xì)胞移植供體；8-12周CB17(H-2d)重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immune deficiency， SCID)小鼠作為脾細(xì)胞移植受體。
　　 2．使用BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2b)及C57BL/6CD61KO小鼠血小板分別免疫BALB/cCD61KO小鼠，并通過檢測(cè)小鼠血清中血小板特異性Ig

6、G抗體滴度監(jiān)測(cè)小鼠所獲得的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。
　　 3．收獲具有較高抗體滴度的BALB/cCD61KO小鼠脾臟，分離單個(gè)脾細(xì)胞，保留所有細(xì)胞亞群或分離去除CD19+B細(xì)胞，分別移植給BALB/cSCID小鼠，觀測(cè)小鼠臨床表型、監(jiān)測(cè)血小板計(jì)數(shù)，并于4周后收獲小鼠，行骨髓病理學(xué)檢測(cè)，觀察小鼠骨髓中巨核細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1．在應(yīng)用三種不同類型血小板分別免疫BALB/cCD61KO小鼠第5周末，

7、小鼠血清中血小板特異性IgG抗體滴度均≥1：400，提示血小板表面GPIIIa及同種異型MHCⅠ類分子均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答。其中，第1、3組抗體水平(＞1：12000)較第2組(1：400)高。
　　 2．將具有相應(yīng)免疫性的脾細(xì)胞（抗CD61、抗MHC及抗CD61/MHC雙陽性），保留/去除CD19+B細(xì)胞亞群后，分別移植給6組BALB/cSCID小鼠，實(shí)驗(yàn)組1、2組小鼠血小板計(jì)數(shù)在第2-4周與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0

8、.05)，并有相應(yīng)出血表現(xiàn)，部分小鼠死亡，骨髓病理切片中巨核細(xì)胞呈成熟障礙象且巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，表明ITP小鼠模型構(gòu)建成功。
　　 3．接受脾細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)組3、4組小鼠在血小板計(jì)數(shù)、臨床表現(xiàn)、巨核細(xì)胞形態(tài)及計(jì)數(shù)等方面均與對(duì)照組小鼠無顯著性差異(P＞0.05)；實(shí)驗(yàn)組第5組小鼠血小板計(jì)數(shù)持續(xù)減低并出現(xiàn)類似ITP小鼠表現(xiàn)，而第6組小鼠血小板計(jì)數(shù)在第2周開始上升，并未出現(xiàn)ITP類似表現(xiàn)(與對(duì)照組相比P＞0.

9、05)，表明抗MHC免疫性并未阻斷T、B細(xì)胞共同介導(dǎo)的ITP，但成功阻斷了T細(xì)胞介導(dǎo)的ITP，提示同種異型血小板MHCⅠ類抗原分子可成功誘導(dǎo)CD61特異性CTL免疫耐受。
　　 結(jié)論：我們的研究表明，血小板特異性抗原CD61及同種異型MHCI類抗原均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答；新型ITP小鼠模型能夠成功地模擬人體ITP發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)理，CD61特異性CTL在發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，而同種異型血小板MHCI類抗原可以成功誘導(dǎo)該