細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在ITP患者血小板破壞中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)，是臨床上最常見的出血性疾病，以外周血中血小板數(shù)目減少為特點(diǎn)。ITP的發(fā)病機(jī)制主要為血小板破壞增多、血小板生成減少及T淋巴細(xì)胞免疫失衡。ITP的一線治療方法主要包括:糖皮質(zhì)激素、靜脈注射用免疫球蛋白(intravenousimmunoglobulin，IVIG)和抗-D免疫球蛋白（anti-D immunoglobulin，anti-D）;二線治療方法包括:

2、脾臟切除術(shù)、促血小板生成素受體(thrombopoietin receptor，TPO-R)激動(dòng)劑、利妥昔單抗、環(huán)孢素和免疫抑制劑等。相當(dāng)一部分患者對(duì)一線及二線治療方法均反應(yīng)不佳，反復(fù)治療遷延不愈成為難治性ITP。
　　ITP患者體內(nèi)血小板破壞增多主要為血小板自身抗體介導(dǎo)，患者體內(nèi)免疫失耐受，產(chǎn)生了針對(duì)血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)的自身抗體，主要為抗血小板GPIb/Ⅸ及GPⅡb/Ⅲa抗體，該抗體可與血小板表面的G

3、P抗原表位結(jié)合，介導(dǎo)血小板被脾臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的單核巨噬細(xì)胞過度清除。
　　研究發(fā)現(xiàn)，ITP中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)可通過穿孔素、顆粒酶B直接裂解血小板，造成血小板破壞增多。并且，ITP中CTLs可導(dǎo)致骨髓巨核細(xì)胞成熟及凋亡障礙從而導(dǎo)致血小板生成減少。上述研究提示，CTLs在ITP的發(fā)病中起非常重要的作用。
　　糖皮質(zhì)激素為ITP患者的一線治療藥物，既往認(rèn)為，常規(guī)劑量潑

4、尼松為治療ITP首選的糖皮質(zhì)激素，近年來，大劑量地塞米松(high-dose dexamethasone，HD-DXM)因其起效時(shí)間短、副反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)勢逐漸取代常規(guī)劑量潑尼松成為ITP患者首選的激素藥物。
　　CD8通常作為CTLs的標(biāo)記，然而，CD8+淋巴細(xì)胞可根據(jù)不同的分子標(biāo)記及功能分為不同的亞群。CD28為多數(shù)T細(xì)胞反應(yīng)所必須的共刺激信號(hào)，CD8+淋巴細(xì)胞中的CD28-細(xì)胞通常發(fā)揮免疫抑制功能，故CD8+CD28-淋巴細(xì)

5、胞也被稱為抑制性T細(xì)胞(suppressor T cells，Ts)。此外，CD8+淋巴細(xì)胞還包括CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryT cells，Tregs）。ITP發(fā)病中CD4+ Tregs的數(shù)量及功能有較多研究，研究證實(shí)，ITP患者體內(nèi)CD4+ Tregs數(shù)量顯著降低，且免疫抑制功能顯著受損，地塞米松、利妥昔單抗、TPO-R激動(dòng)劑等藥物可顯著改善ITP患者的CD4+ Tregs的數(shù)量和/或功能。
　　除了血小板自身抗

6、體及CTLs介導(dǎo)的血小板破壞外，肝細(xì)胞介導(dǎo)的去唾液酸化血小板的吞噬破壞成為近年來日益受到研究者重視的血小板破壞方式。血小板去唾液酸化是指血小板糖蛋白上的唾液酸基團(tuán)被唾液酸酶(neuraminidase，NA)剪切掉，暴露出β半乳糖(β-galactoses，βGals)殘基的過程，暴露的βGals被肝細(xì)胞無唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptors，ASGPRs）所識(shí)別、結(jié)合并介導(dǎo)血小板在肝臟中被清除，是

7、血小板清除的重要途徑。由于ITP患者中血小板自身抗體和CTLs均可活化或損傷血小板，血小板去唾液酸化可能參與ITP的發(fā)病。截至目前，ITP患者中血小板去唾液酸化的水平、與血小板自身抗體和CTLs的關(guān)系、對(duì)體內(nèi)血小板破壞的影響等均未闡明。
　　以ITP患者及小鼠模型為研究對(duì)象，通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，深入研究ITP患者外周血CD8+淋巴細(xì)胞亞群包括CTLs、Ts、Tregs的水平、HD-DXM治療后上述細(xì)胞亞群的變化、血小板

8、去唾液酸化的水平及其對(duì)血小板破壞的影響、血小板自身抗體特異性及CTLs殺傷作用與血小板去唾液酸化的關(guān)系，深入揭示ITP患者體內(nèi)血小板破壞的新機(jī)制。
　　第一部分 大劑量地塞米松對(duì)ITP中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)控作用的研究
　　目的:檢測ITP患者和正常對(duì)照外周血中CD8+淋巴細(xì)胞各亞群比例，包括CTLs、Ts、Tregs;檢測ITP患者和正常對(duì)照外周血血漿中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggro

9、wth factor-β1，TGF-β1)及白介素10(interleukin10，IL-10)的水平;檢測HD-DXM治療前后ITP患者CD8+淋巴細(xì)胞各亞群及血漿TGF-β1、IL-10水平的變化。明確ITP患者中是否存在CD8+淋巴細(xì)胞各亞群的數(shù)量異常，探討HD-DXM治療ITP可能的新機(jī)制。
　　方法:1.入組21例初診的ITP患者，接受4天連續(xù)HD-DXM(40mg/d)治療，治療前收取外周血，治療開始14天后，評(píng)價(jià)臨床

10、療效及副反應(yīng)，并且收取外周血。同時(shí)入組16例健康志愿者作為正常對(duì)照。
　　2.血常規(guī)檢測血小板數(shù)目，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)及血漿。
　　3.以APC-CD8、FITC-CD28、PE-Cy5-CD25及PE-Foxp3單克隆抗體標(biāo)記PBMCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測ITP患者及正常對(duì)照淋巴細(xì)胞中CD8、CD28、CD25及Foxp3的表達(dá)情況。
　

11、　4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測ITP患者及正常對(duì)照血漿中TGF-β1及IL-10水平。
　　結(jié)果:1.接受HD-DXM治療的ITP患者，14天后完全反應(yīng)(complete response，CR)、反應(yīng)(response，R)及無反應(yīng)(no response，NR)率分別為57.14％、28.57％及14.29％，均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。
　　2.

12、ITP患者淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞比例與正常對(duì)照無明顯差別，并且HD-DXM治療前后ITP患者淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞比例也無明顯變化。
　　3.ITP患者CD8+淋巴細(xì)胞中CTLs(CD8+CD28+)比例明顯高于正常對(duì)照，同時(shí)Ts細(xì)胞(CD8+CD28-)比例低于正常對(duì)照。HD-DXM治療可有效降低ITP患者CD8+淋巴細(xì)胞中CTLs比例同時(shí)升高Ts細(xì)胞比例。
　　結(jié)論:1.CD8+淋巴細(xì)胞中CTLs比例升高、Ts及Treg

13、s比例下降可能參與ITP的發(fā)病。
　　2.HD-DXM治療可顯著降低CD8+淋巴細(xì)胞中CTLs比例同時(shí)升高CD8+淋巴細(xì)胞中Ts及Tregs比例，可能是HD-DXM治療ITP的療效機(jī)制之一。
　　第二部分 ITP中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致血小板去唾液酸化的機(jī)制研究
　　目的:檢測ITP患者和正常對(duì)照血小板自身抗體、CTLs介導(dǎo)的血小板破壞及血小板去唾液酸化水平，分析血小板去唾液酸化水平與血小板自身抗體特異性及CTLs介導(dǎo)

14、的血小板破壞的相關(guān)性;檢測ITP患者治療前后的血小板去唾液酸化水平，分析其與療效的關(guān)系;將ITP患者血漿及CTLs與血小板體外共同孵育，檢測孵育后血小板去唾液酸化及唾液酸酶1（neuraminidase1，Neu1）表達(dá)水平;利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確去唾液酸化的血小板在肝臟中的破壞情況。從而明確ITP患者中是否存在血小板去唾液酸化水平的異常，血小板去唾液酸化水平在ITP病程進(jìn)展中的變化，血小板自身抗體及CTLs是否可引起血小板去唾液酸化及具體機(jī)

15、制，以及去唾液酸化的血小板在體內(nèi)的破壞情況。
　　方法:1.收取活動(dòng)性ITP患者治療前后及正常對(duì)照外周血，血常規(guī)檢測血小板數(shù)目，離心獲取血漿、PBMCs及血小板。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板表面去唾液酸化后暴露的βGals的水平，即以PE-Cy5-CD41a單克隆抗體標(biāo)記血小板，并同時(shí)標(biāo)以FITC-RCA-I，RCA-I的平均熒光強(qiáng)度用來反映血小板去唾液酸化水平。
　　3.改良直接單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(shù)（mon

16、oclonal antibody-specificimmobilization of platelet antigens，MAIPA）檢測ITP患者血漿中的抗血小板GPIb、GPⅡb/Ⅲa抗體。
　　結(jié)果:1.ITP患者血小板RCA-I的平均熒光強(qiáng)度顯著高于正常對(duì)照。ITP患者治療后CR、R及NR率分別為19.36％、45.16％及35.48％，CR及R患者治療后RCA-I的平均熒光強(qiáng)度較治療前顯著降低，而NR患者治療前后RCA-

17、I的平均熒光強(qiáng)度無顯著差異。
　　2.ITP患者中17.57％ GPIb抗體單陽性，13.51％ GPⅡb/Ⅲa抗體單陽性，21.62％兩者均陽性，47.30％兩者均陰性。GPIb抗體陽性組及陰性組，GPⅡb/Ⅲa抗體陽性組與陰性組，血小板抗體陽性組與陰性組，血小板RCA-I的平均熒光強(qiáng)度均無顯著差異。
　　結(jié)論:1.ITP患者血小板去唾液酸化水平顯著高于正常對(duì)照，治療后有效的ITP患者血小板去唾液酸化水平降低，而無效的IT