UB-HBcAg-CTP融合蛋白誘導特異性細胞毒性T淋巴細胞反應的實驗研究.pdf

1、慢性乙型肝炎仍是嚴重危害人類健康的疾病，現(xiàn)今全球大約有3.5億人感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）。目前采取的治療方法，均不能徹底清除病毒而使病毒持續(xù)存在于肝細胞內(nèi)，造成感染慢性化，并可繼發(fā)肝硬化、肝細胞癌。機體清除HBV感染起關(guān)鍵作用的是HBV特異性細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UP

2、S）是一種高度選擇性的蛋白降解系統(tǒng)，它廣泛存在于真核細胞內(nèi)，并依靠ATP酶而起作用，對維持細胞乃至整個生物體的正常生理功能具有重要的作用。泛素化的抗原蛋白被蛋白酶體復合物識別后被降解為若干小肽段，與主要組織相容性復合體-Ⅰ(majorhistocompatibility complex，MHC)類分子結(jié)合后被抗原提呈細胞識別，誘導特異性CTL反應。目前有許多研究表明，泛素化的抗原進入細胞后可被UPS系統(tǒng)有效降解及提呈，從而增強抗原誘導的

3、免疫應答。
　　正常情況下，由于膜屏障的存在，蛋白、多肽等很難進入細胞內(nèi)，某些蛋白具有很強的不依賴于受體的跨膜活性，這類短肽被稱為細胞穿透肽(cellpenetrating peptide，CPP)。目前應用最為廣泛的細胞穿透肽是HIV-Tat(humanimmunodeficiency virus transactivator oftranscription,HIV-Tat)蛋白。PTD(proteintransduction

4、domain)是Tat蛋白行使跨膜功能的核心片段，包含該區(qū)段的蛋白具有穿透細胞膜的功能。胞漿轉(zhuǎn)導肽（cytoplasmic transduction peptide，CTP）為PTD的衍生體，是一種新型的轉(zhuǎn)導肽系統(tǒng)，它去除了核定位信號而能攜帶蛋白類大分子穿越細胞膜并專一性定位于胞漿中的。本研究通過構(gòu)建Ub-HBcAg-CTP融合基因表達質(zhì)粒，并進行蛋白的表達及純化，利用Ub-HBcAg-CTP融合蛋白體外刺激樹突狀細胞(dendriti

5、c cell，DC)成熟并誘導特異性CTL，體內(nèi)免疫BALB/c小鼠，對Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導特異性CTL的免疫功能進行了探討。
　　實驗共分三部分:(1) Ub-HBcAg-CTP融合蛋白的表達、純化及其體外誘導小鼠髓源性樹突狀細胞成熟的研究;(2) Ub-HBcAg-CTP融合蛋白促進T淋巴細胞增殖，誘導特異性CTL反應的體外研究;(3) Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫BALB/c小鼠誘導特異性CTL反應的

6、體內(nèi)研究。
　　第一部分 Ub-HBcAg-CTP融合蛋白的表達、純化及其體外誘導小鼠髓源性樹突狀細胞成熟的研究
　　目的:構(gòu)建Ub-HBcAg-CTP融合基因的原核表達載體，并進行蛋白的表達及其純化，體外觀察其對誘導小鼠髓源性樹突狀細胞成熟的作用。
　　方法:以質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Ub-HBcAg中的Ub-HBcAg融合基因為模板設(shè)計引物，上游引物帶有CTP基因序列，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物克隆到原核表達質(zhì)

7、粒pMAL-c2X中，菌落PCR陽性克隆測序，鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并進行蛋白純化及Western blotting鑒定。同時構(gòu)建并表達對照組蛋白HBcAg-CTP及Ub-HBcAg。體外分離培養(yǎng)近交系BALB/c小鼠髓源性樹突狀細胞，加重組白細胞介素-4（interleukin，IL-4）及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating fact

8、or，GM-CSF）。樹突狀細胞培養(yǎng)至第5天時加入Ub-HBcAg-CTP、HBcAg-CTP、Ub-HBcAg及HBcAg誘導DC成熟。激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光在細胞中的分布及定位，并對熒光強度進行定量分析，流式細胞術(shù)檢測樹突狀細胞表面分子的表達，并以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測樹突狀細胞的上清液中細胞因子IL-12p70的含量。
　　結(jié)果:PCR擴增分別得到820 bp、590 bp及780 bp大小的條帶，分別為Ub

9、-HBcAg-CTP、HBcAg-CTP及Ub-HBcAg融合基因。將其克隆至表達質(zhì)粒pMAL-c2X中，陽性克隆菌落測序正確，并在DE3中獲得誘導表達。Westernblotting鑒定分別為Ub-HBcAg-CTP、HBcAg-CTP及Ub-HBcAg融合蛋白。體外成功誘導培養(yǎng)并鑒定小鼠骨髓源性DC，免疫熒光法證實Ub-HBcAg-CTP能夠穿透DC膜進入細胞質(zhì)，而不能進入細胞核;Ub-HBcAg-CTP能明顯上調(diào)DC表面分子CD8

10、0、CD83、CD86及MHC-Ⅰ類分子的表達;Ub-HBcAg-CTP組誘導DC分泌的IL-12p70水平明顯高于對照組。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了Ub-HBcAg-CTP及對照融合表達質(zhì)粒并誘導表達，Ub-HBcAg-CTP具有穿透樹突狀細胞膜并定位于胞漿的能力，明顯增強DC表面共刺激分子的表達及促進DC的成熟及分化，明顯增強DC分泌IL-12p70等細胞因子的能力。
　　第二部分Ub-HBcAg-CTP融合蛋白促進T淋巴細

11、胞增殖，誘導特異性CTL反應的體外研究
　　目的:探討經(jīng)Ub-HBcAg-CTP融合蛋白致敏的DC體外增強T淋巴細胞增殖能力及誘導特異性細胞毒T淋巴細胞(CTLs)的作用。
　　方法:體外分離培養(yǎng)小鼠髓源性DC，不同組融合蛋白加入樹突狀細胞中誘導其成熟及分化后，與分離培養(yǎng)的小鼠T淋巴細胞共同培養(yǎng)，ELISA法檢測T細胞上清液中干擾素(interferon，IFN)-γ、 IL-2、IL-4及IL-10的分泌水平，流式細胞儀檢

12、測胞內(nèi)細胞因子水平，細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)試劑盒檢測T淋巴細胞增殖反應，乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗檢測特異性CTL活性。
　　結(jié)果:Ub-HBcAg-CTP融合蛋白可以明顯上調(diào)細胞因子IFN-γ和IL-2的水平;流式細胞儀檢測的由Ub-HBcAg-CTP融合蛋白所誘導的CTL水平明顯高于對照組及空白組;Ub-HBcAg-CTP誘導樹突狀細胞刺激T細胞增殖能力明顯高于對照組;Ub-HBcAg-CTP融合蛋白組誘導的CTL

13、與對照組相比，具有明顯的特異性殺傷作用。
　　結(jié)論:經(jīng)Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導成熟的DC能明顯刺激Th1型細胞因子的分泌，增強T淋巴細胞增殖能力，明顯增加CTLs的表達并增強特異性CTL活性。
　　第三部分Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫BALB/c小鼠誘導特異性CTL反應的體內(nèi)研究
　　目的:探討Ub-HBcAg-CTP融合蛋白在BALB/c小鼠體內(nèi)有效誘導HBV特異性CTL反應，并初步探討Ub-HB

14、cAg-CTP融合蛋白誘導CTL的機制，研究Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導CTL與JAK/STAT信號通路的關(guān)系。
　　方法:BALB/c小鼠隨機分為實驗組Ub-HBcAg-CTP（50μg），對照組HBcAg-CTP（50μg）、Ub-HBcAg（50μg）、HBcAg（50μg）及空白組(100μl生理鹽水)，經(jīng)肌肉免疫小鼠，每周一次，共3次。最后一次免疫后1周，收集小鼠T淋巴細胞，ELISA法檢測T淋巴細胞分泌細胞因子

15、;流式細胞儀檢測T淋巴細胞內(nèi)的細胞因子;酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)法檢測特異性T淋巴細胞;CCK-8試劑盒檢測T淋巴細胞增殖活性;LDH釋放試驗檢測特異性CTL活性;Western blotting法檢測小鼠T淋巴細胞JAK/STAT信號通路中各信號分子的表達水平。
　　結(jié)果:Ub-HBcAg-CTP融合蛋白能有效刺激小鼠T淋巴細胞分泌Th1型細胞因子;流式細胞儀及ELISPOT法檢測該融合蛋白誘導的CTL水平明顯高于其他組;

16、且該融合蛋白誘導的T淋巴細胞增殖活性和CTL活性明顯高于對照組及空白組;Ub-HBcAg-CTP融合蛋白可以明顯上調(diào)T淋巴細胞內(nèi)Jak2，Tyk2，STAT1及STAT4的表達水平，而對Jak1，Jak3及STAT6的表達無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫BALB/c小鼠后，能有效刺激T淋巴細胞分泌Th1型細胞因子及增加CTLs的表達，并能提高T淋巴細胞增殖活性及CTL活性，以上免疫效應可能與JAK/S