UB-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性乙型肝炎仍是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，現(xiàn)今全球大約有3.5億人感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）。目前采取的治療方法，均不能徹底清除病毒而使病毒持續(xù)存在于肝細(xì)胞內(nèi)，造成感染慢性化，并可繼發(fā)肝硬化、肝細(xì)胞癌。機(jī)體清除HBV感染起關(guān)鍵作用的是HBV特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UP

2、S）是一種高度選擇性的蛋白降解系統(tǒng)，它廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，并依靠ATP酶而起作用，對(duì)維持細(xì)胞乃至整個(gè)生物體的正常生理功能具有重要的作用。泛素化的抗原蛋白被蛋白酶體復(fù)合物識(shí)別后被降解為若干小肽段，與主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ(majorhistocompatibility complex，MHC)類分子結(jié)合后被抗原提呈細(xì)胞識(shí)別，誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)。目前有許多研究表明，泛素化的抗原進(jìn)入細(xì)胞后可被UPS系統(tǒng)有效降解及提呈，從而增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的

3、免疫應(yīng)答。
　　正常情況下，由于膜屏障的存在，蛋白、多肽等很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，某些蛋白具有很強(qiáng)的不依賴于受體的跨膜活性，這類短肽被稱為細(xì)胞穿透肽(cellpenetrating peptide，CPP)。目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞穿透肽是HIV-Tat(humanimmunodeficiency virus transactivator oftranscription,HIV-Tat)蛋白。PTD(proteintransduction

4、domain)是Tat蛋白行使跨膜功能的核心片段，包含該區(qū)段的蛋白具有穿透細(xì)胞膜的功能。胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽（cytoplasmic transduction peptide，CTP）為PTD的衍生體，是一種新型的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽系統(tǒng)，它去除了核定位信號(hào)而能攜帶蛋白類大分子穿越細(xì)胞膜并專一性定位于胞漿中的。本研究通過(guò)構(gòu)建Ub-HBcAg-CTP融合基因表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行蛋白的表達(dá)及純化，利用Ub-HBcAg-CTP融合蛋白體外刺激樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriti

5、c cell，DC)成熟并誘導(dǎo)特異性CTL，體內(nèi)免疫BALB/c小鼠，對(duì)Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)特異性CTL的免疫功能進(jìn)行了探討。
　　實(shí)驗(yàn)共分三部分:(1) Ub-HBcAg-CTP融合蛋白的表達(dá)、純化及其體外誘導(dǎo)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的研究;(2) Ub-HBcAg-CTP融合蛋白促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的體外研究;(3) Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的

6、體內(nèi)研究。
　　第一部分 Ub-HBcAg-CTP融合蛋白的表達(dá)、純化及其體外誘導(dǎo)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的研究
　　目的:構(gòu)建Ub-HBcAg-CTP融合基因的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行蛋白的表達(dá)及其純化，體外觀察其對(duì)誘導(dǎo)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的作用。
　　方法:以質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Ub-HBcAg中的Ub-HBcAg融合基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，上游引物帶有CTP基因序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆到原核表達(dá)質(zhì)

7、粒pMAL-c2X中，菌落PCR陽(yáng)性克隆測(cè)序，鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并進(jìn)行蛋白純化及Western blotting鑒定。同時(shí)構(gòu)建并表達(dá)對(duì)照組蛋白HBcAg-CTP及Ub-HBcAg。體外分離培養(yǎng)近交系BALB/c小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞，加重組白細(xì)胞介素-4（interleukin，IL-4）及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating fact

8、or，GM-CSF）。樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)至第5天時(shí)加入U(xiǎn)b-HBcAg-CTP、HBcAg-CTP、Ub-HBcAg及HBcAg誘導(dǎo)DC成熟。激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光在細(xì)胞中的分布及定位，并對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子的表達(dá)，并以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞的上清液中細(xì)胞因子IL-12p70的含量。
　　結(jié)果:PCR擴(kuò)增分別得到820 bp、590 bp及780 bp大小的條帶，分別為Ub

9、-HBcAg-CTP、HBcAg-CTP及Ub-HBcAg融合基因。將其克隆至表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X中，陽(yáng)性克隆菌落測(cè)序正確，并在DE3中獲得誘導(dǎo)表達(dá)。Westernblotting鑒定分別為Ub-HBcAg-CTP、HBcAg-CTP及Ub-HBcAg融合蛋白。體外成功誘導(dǎo)培養(yǎng)并鑒定小鼠骨髓源性DC，免疫熒光法證實(shí)Ub-HBcAg-CTP能夠穿透DC膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而不能進(jìn)入細(xì)胞核;Ub-HBcAg-CTP能明顯上調(diào)DC表面分子CD8

10、0、CD83、CD86及MHC-Ⅰ類分子的表達(dá);Ub-HBcAg-CTP組誘導(dǎo)DC分泌的IL-12p70水平明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了Ub-HBcAg-CTP及對(duì)照融合表達(dá)質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達(dá)，Ub-HBcAg-CTP具有穿透樹(shù)突狀細(xì)胞膜并定位于胞漿的能力，明顯增強(qiáng)DC表面共刺激分子的表達(dá)及促進(jìn)DC的成熟及分化，明顯增強(qiáng)DC分泌IL-12p70等細(xì)胞因子的能力。
　　第二部分Ub-HBcAg-CTP融合蛋白促進(jìn)T淋巴細(xì)

11、胞增殖，誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的體外研究
　　目的:探討經(jīng)Ub-HBcAg-CTP融合蛋白致敏的DC體外增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞增殖能力及誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)的作用。
　　方法:體外分離培養(yǎng)小鼠髓源性DC，不同組融合蛋白加入樹(shù)突狀細(xì)胞中誘導(dǎo)其成熟及分化后，與分離培養(yǎng)的小鼠T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，ELISA法檢測(cè)T細(xì)胞上清液中干擾素(interferon，IFN)-γ、 IL-2、IL-4及IL-10的分泌水平，流式細(xì)胞儀檢

12、測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子水平，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)試劑盒檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗(yàn)檢測(cè)特異性CTL活性。
　　結(jié)果:Ub-HBcAg-CTP融合蛋白可以明顯上調(diào)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的水平;流式細(xì)胞儀檢測(cè)的由Ub-HBcAg-CTP融合蛋白所誘導(dǎo)的CTL水平明顯高于對(duì)照組及空白組;Ub-HBcAg-CTP誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組;Ub-HBcAg-CTP融合蛋白組誘導(dǎo)的CTL

13、與對(duì)照組相比，具有明顯的特異性殺傷作用。
　　結(jié)論:經(jīng)Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)成熟的DC能明顯刺激Th1型細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞增殖能力，明顯增加CTLs的表達(dá)并增強(qiáng)特異性CTL活性。
　　第三部分Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的體內(nèi)研究
　　目的:探討Ub-HBcAg-CTP融合蛋白在BALB/c小鼠體內(nèi)有效誘導(dǎo)HBV特異性CTL反應(yīng)，并初步探討Ub-HB

14、cAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)CTL的機(jī)制，研究Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)CTL與JAK/STAT信號(hào)通路的關(guān)系。
　　方法:BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組Ub-HBcAg-CTP（50μg），對(duì)照組HBcAg-CTP（50μg）、Ub-HBcAg（50μg）、HBcAg（50μg）及空白組(100μl生理鹽水)，經(jīng)肌肉免疫小鼠，每周一次，共3次。最后一次免疫后1周，收集小鼠T淋巴細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子

15、;流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子;酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)法檢測(cè)特異性T淋巴細(xì)胞;CCK-8試劑盒檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖活性;LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)特異性CTL活性;Western blotting法檢測(cè)小鼠T淋巴細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路中各信號(hào)分子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:Ub-HBcAg-CTP融合蛋白能有效刺激小鼠T淋巴細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子;流式細(xì)胞儀及ELISPOT法檢測(cè)該融合蛋白誘導(dǎo)的CTL水平明顯高于其他組;

16、且該融合蛋白誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖活性和CTL活性明顯高于對(duì)照組及空白組;Ub-HBcAg-CTP融合蛋白可以明顯上調(diào)T淋巴細(xì)胞內(nèi)Jak2，Tyk2，STAT1及STAT4的表達(dá)水平，而對(duì)Jak1，Jak3及STAT6的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫BALB/c小鼠后，能有效刺激T淋巴細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子及增加CTLs的表達(dá)，并能提高T淋巴細(xì)胞增殖活性及CTL活性，以上免疫效應(yīng)可能與JAK/S