STAT3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、目的：
　　信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription3，STAT3)是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族(Signal transducor and activator of transcription，STATs)的重要成員。其被生長因子與細(xì)胞因子等細(xì)胞外信號物質(zhì)激活，可調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞凋亡，并與其增生與分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。最近的研究結(jié)果表明：S

2、TAT3蛋白的異?；罨c頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、惡性淋巴瘤、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本研究旨在觀察信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)和活化，探討其表達(dá)水平及磷酸化狀態(tài)與性別、年齡、腫瘤大小等臨床病理特征的關(guān)系及對預(yù)后的影響。通過體外干擾實(shí)驗(yàn)，探討STAT3在肺癌細(xì)胞生長、增殖上的作用，進(jìn)一步闡明STAT3在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　1.

3、收集病例資料完整的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本127例，其中腺癌100例，鱗癌27例。同時(shí)收集癌旁組織標(biāo)本56例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測p-STAT3在腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)合臨床資料進(jìn)行對比分析，研究p-STAT3的表達(dá)與患者年齡、性別、臨床分期、EGFR突變狀態(tài)等臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步進(jìn)行生存分析，觀察表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系。
　　2.構(gòu)建靶向沉默STAT3基因的shRNA載體，F(xiàn)ugene6轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備病毒，感染人

4、肺癌A549細(xì)胞，通過嘌呤霉素(puromycin)篩選陽性表達(dá)克隆，WesternBlot對基因干擾效果進(jìn)行鑒定、分析，進(jìn)而篩選出穩(wěn)定干擾細(xì)胞系。采用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察STAT3干擾后肺癌A549細(xì)胞增殖狀態(tài)改變。
　　結(jié)果：
　　1、P-STAT3的表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞核中、在肺癌組織中高表達(dá)，其陽性率為64.6％(82/127)、癌旁組織中為37.5％(21/56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)

5、。表達(dá)水平與EGFR突變狀態(tài)、性別、吸煙史、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小、病理類型無關(guān)(P>0.05)。生存分析發(fā)現(xiàn)，p-STAT3陽性表達(dá)組的總生存時(shí)間顯著縮短(P=0.048)。
　　2、酶切及測序結(jié)果表明構(gòu)建的慢病毒載體pLKO-STAT3-shRNA之插入序列正確。
　　3、Fugene6轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒進(jìn)行細(xì)胞感染與嘌呤霉素篩選。篩選結(jié)果顯示空白對照組的細(xì)胞全部死亡，而pLK

6、O-STAT3-shRNA病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)明顯而且數(shù)量較多的細(xì)胞克隆形成。
　　4、Western-blot鑒定干擾效果以及STAT3表達(dá)水平改變的結(jié)果顯示shRNA-STAT3感染組的STAT3的表達(dá)明顯減少，而空白對照組細(xì)胞STAT3的表達(dá)未見改變。
　　5、MTT檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)的結(jié)果顯示：pLKO-STAT3一shRNA陽性A549細(xì)胞同空白對照組相比，表現(xiàn)出較明顯的抑制效應(yīng)(P<0.05)，且其抑制效應(yīng)隨時(shí)間延長愈

7、明顯，表現(xiàn)出一定的時(shí)間抑制效應(yīng)關(guān)系。
　　6、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：shRNA-sTAT3感染組A549細(xì)胞克隆形成率(15.18±2.33)％明顯低于空白對照組(26.34±2.17)％(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，干擾STAT3表達(dá)影響細(xì)胞增殖。表達(dá)水平與EGFR突變狀態(tài)有關(guān)，有可能作為評價(jià)EGFR-