Hepcidin在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖生長的研究.pdf

1、目的:肺癌是世界上最常見的癌癥，每年新發(fā)病例接近120萬，同時也是男性癌癥死亡的主要原因。而在女性中，肺癌是第四常見的癌癥，也是癌癥死亡中排名第二的主要原因.根據(jù)組織學(xué)形態(tài)分類，肺癌可以被分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌兩種類型，而非小細(xì)胞肺癌在原發(fā)肺癌中所占比例超過85％。鐵是所有生命細(xì)胞基本活動所必需的。很多動物模型和流行病學(xué)調(diào)查表明，過量的鐵是促進(jìn)惡性腫瘤產(chǎn)生的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)鐵代謝的調(diào)控跟Hepcidin

2、關(guān)系十分密切。Hepcidin是一種主要由肝臟合成分泌的小分子多肽，在心臟、腦、肺、胰腺等其他組織器官中也有一定的表達(dá)。人類Hepcidin由HAMP基因轉(zhuǎn)錄并翻譯。Hepcidin主要是通過與細(xì)胞表面控制鐵釋放的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ferroportin的結(jié)合，使其被內(nèi)陷入細(xì)胞質(zhì)中被溶酶體吞噬降解，從而抑制細(xì)胞內(nèi)鐵的輸出。近來對于Hepcidin在腫瘤中的關(guān)系和作用越來越受重視，研究顯示Hepcidin在肝細(xì)胞癌和腎細(xì)胞癌中的表達(dá)是下調(diào)的，但

3、在結(jié)腸癌和乳腺癌中表達(dá)卻升高。目前尚無相關(guān)研究報道Hepcidin與肺癌的關(guān)系，因此本課題著重于研究Hepcidin-25在NSCLC患者血液循環(huán)中的表達(dá)情況，分析Hepcidin和其相關(guān)信號通路因子IL-6及BMP在NSCLC患者中的關(guān)系;檢測Hepcidin在肺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，分析其與病理學(xué)特征的關(guān)系;進(jìn)一步通過細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分析Hepcidin與肺癌細(xì)胞生長情況的關(guān)系，并且研究并初步闡明Hepcidin在肺癌細(xì)胞增殖生長過

4、程中的作用機(jī)制。
　　方法:采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)分別檢測53例NSCLC患者和16例健康志愿者的血清Hepcidin-25、IL-6和BMP2的含量水平，分析與肺癌病理學(xué)特征之間的關(guān)系以及相互之間的關(guān)系。通過實(shí)時熒光定量PCR檢測65例NSCLC患者的肺癌組織樣本和正常肺組織樣本中的Hepcidin mRNA表達(dá)水平;同時用免疫組織化學(xué)法檢測65例NSCLC組織標(biāo)本和57例正常肺組織標(biāo)本中Hepcidin的定位及表達(dá)情況。

5、進(jìn)一步測定了6種NSCLC細(xì)胞株和支氣管上皮細(xì)胞株HBE中Hepcidin mRNA的表達(dá)水平，選擇表達(dá)合適的H520細(xì)胞株通過細(xì)胞免疫熒光觀察Hepcidin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況;構(gòu)建Hepcidin真核表達(dá)載體使Hepcidin在HBE細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，運(yùn)用WST-8試驗(yàn)和細(xì)胞平板克隆形成試驗(yàn)研究Hepcidin表達(dá)水平升高對細(xì)胞增殖生長的影響;同時用RNA干擾技術(shù)降低H520細(xì)胞內(nèi)Hepcidin的表達(dá)，運(yùn)用WST-8試驗(yàn)和細(xì)胞平板克隆

6、形成試驗(yàn)研究Hepcidin表達(dá)水平下降對細(xì)胞增殖生長的影響;通過WST-8試驗(yàn)檢測人工合成Hepcidin結(jié)合域（HBD）對H520細(xì)胞的影響，分析HBD在肺癌細(xì)胞生長過程中的作用。此外還應(yīng)用熒光測量法檢測Hepcidin過表達(dá)的HBE細(xì)胞和Hepcidin表達(dá)下降的H520細(xì)胞內(nèi)的可變鐵池(LIP)的變化，進(jìn)一步闡明Hepcidin促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖生長的機(jī)制。
　　結(jié)果:NSCLC患者的血清Hepcidin-25顯著高于健康志

7、愿者(P=0.004)。NSCLC患者血清Hepcidin-25水平隨NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生而升高(P=0.044);同時，血清Hepcidin-25水平還跟TNM臨床分期呈正相關(guān)，隨臨床分期的提高而升高(P=0.017)。通過進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)IL-6在NSCLC患者和健康志愿者之間沒有明顯差別(P=0.917)，但是發(fā)現(xiàn)IL-6水平在NSCLC患者中隨著肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生(P=0.018)和TNM臨床分期的提高(P=0.041)

8、而下降。血清BMP-2在NSCLC患者中的含量水平要顯著高于健康志愿者(P＜0.01);而BMP-2水平跟淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生(P=0.011)和TNM臨床分期(P=0.001)呈正相關(guān)。通過spearman's相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者中，Hepcidin-25和IL-6含量成負(fù)相關(guān)(r=-0.242，P=0.049)，而與BMP-2呈正相關(guān)(r=0.737，P＜0.001)。
　　實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)65例NSCLC

9、患者的肺癌組織標(biāo)本中有67.7％的Hepcidin mRNA表達(dá)高于正常肺組織，只有30.8％低于正常肺組織，僅有1.5％與正常肺組織無差異，說明NSCLC組織標(biāo)本的Hepcidin mRNA表達(dá)升高(P＜0.01);通過Hepcidin mRNA相對于beta-actin的比值（即2-△CT值）進(jìn)行l(wèi)og10換算標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行統(tǒng)計比較也得出肺癌組織標(biāo)本的Hepcidin mRNA表達(dá)升高(P=0.001);此外，分析發(fā)現(xiàn)肺癌組織標(biāo)本中He

10、pcidin mRNA與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈正相關(guān)(P=0.041)，并且與血清Hepcidin-25水平呈正相關(guān)(r=0.280，P=0.042)。免疫組織化學(xué)顯示非小細(xì)胞肺癌中的Hepcidin陽性表達(dá)較正常肺組織明顯提高(P＜0.05)。
　　通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)6種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株有4種Hepcidin mRNA較HBE表達(dá)升高，僅有2種表達(dá)降低。我們選擇Hepcidin mRNA表達(dá)最高的H520細(xì)胞株進(jìn)行

11、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，觀察發(fā)現(xiàn)Hepcidin在H520細(xì)胞中顯著表達(dá)，且主要集中于細(xì)胞質(zhì)及近細(xì)胞膜部分。成功構(gòu)建Hepcidin真核表達(dá)載體，并成功將其轉(zhuǎn)入HBE細(xì)胞使其穩(wěn)定高表達(dá)Hepcidin;WST-8試驗(yàn)和平板克隆形成試驗(yàn)表明，Hepcidin表達(dá)水平提高對HBE細(xì)胞的增殖生長有明顯的促進(jìn)作用。使用RNA干擾技術(shù)對H520細(xì)胞進(jìn)行Hepcidin基因沉默;WST-8試驗(yàn)和平板克隆形成試驗(yàn)表明，Hepcidin表達(dá)水平下降對H520

12、細(xì)胞的增殖生長有著明顯的抑制作用。用人工合成的HBD對H520細(xì)胞增殖生長進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，被HBD干預(yù)后的H520細(xì)胞其增殖生長受到了一定的抑制。熒光測量法檢測細(xì)胞內(nèi)的可變鐵池(LIP)的結(jié)果表明，提高HBE細(xì)胞內(nèi)Hepcidin的表達(dá)可以使細(xì)胞內(nèi)鐵濃度升高，而降低H520細(xì)胞內(nèi)Hepcidin的表達(dá)卻使其細(xì)胞內(nèi)鐵濃度下降。
　　結(jié)論:Hepcidin在非小細(xì)胞肺癌患者血清及肺癌組織中表達(dá)明顯升高，并且與肺癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及臨床分

13、期呈正相關(guān)。同時，NSCLC患者的血清BMP-2含量明顯增加，與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期呈正相關(guān)，并與血清Hepcidin-25水平呈正相關(guān)，證實(shí)了BMP-2可能是調(diào)節(jié)Hepcidin的關(guān)鍵因素。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Hepcidin能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖生長，其與細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的改變相關(guān)，闡述了Hepcidin-Ferroportin-鐵這個調(diào)控軸對肺癌細(xì)胞增殖生長的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為Hepcidin可以作為腫瘤治療的一個新的靶