低劑量UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)中自噬的變化觀(guān)察.pdf

1、近年來(lái)，紫外線(xiàn)與人皮膚健康的關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)。紫外線(xiàn)是把“雙刃劍”，一方面，紫外線(xiàn)一直被認(rèn)為是皮膚的殺手，除了可能導(dǎo)致各種光敏性皮膚病，過(guò)多的紫外線(xiàn)照射也是造成皮膚光老化及暴露部位皮膚癌多發(fā)的最重要因素;另一方面，紫外線(xiàn)也存在有益的生物學(xué)效應(yīng)，接受適當(dāng)?shù)淖贤饩€(xiàn)照射可以提高機(jī)體免疫力，預(yù)防某些自身免疫性疾病，促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，減少腫瘤的發(fā)生。這些有益的生物效應(yīng)可能與其低劑量照射誘導(dǎo)的興奮效應(yīng)存在一致的關(guān)系。適應(yīng)性反應(yīng)是輻射興奮效應(yīng)的

2、重要內(nèi)容。我們前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)低劑量的長(zhǎng)波紫外線(xiàn)(UVA)輻射可以誘導(dǎo)培養(yǎng)皮膚細(xì)胞出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)[1]，這種適應(yīng)性反應(yīng)表現(xiàn)為單次或多次低劑量UVA預(yù)照射能減輕隨后致死劑量UVA照射對(duì)培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的毒性反應(yīng)，并使細(xì)胞凋亡的比例下降、DNA鏈斷裂減少及修復(fù)加快，但這種適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。自噬(autophagy)是真核細(xì)胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，是將細(xì)胞內(nèi)變形、衰老或損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中消化降解的一種

3、代謝過(guò)程。自噬有利于為此細(xì)胞和組織的動(dòng)態(tài)平衡，是維持真核細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的自我穩(wěn)定并實(shí)現(xiàn)更新的一種有效途徑，也是其適應(yīng)環(huán)境變化的一種重要的防御機(jī)制，但低劑量UVA照射誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)與自噬之間的相關(guān)性目前仍末見(jiàn)報(bào)道。本文觀(guān)察了低劑量UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)中自噬的變化，探討其在誘導(dǎo)培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的可能作用，為全面闡明低劑量UVA誘導(dǎo)人皮膚細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　1.觀(guān)察

4、低劑量長(zhǎng)波紫外線(xiàn)誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)中自噬的形態(tài)及數(shù)量的變化，對(duì)比不同組細(xì)胞的自噬形態(tài)及數(shù)量的差異。
　　2.通過(guò)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1來(lái)探討低劑量UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)中自噬的可能機(jī)制。
　　3.探討自噬在誘導(dǎo)培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的可能作用。
　　方法:
　　1.取18歲健康男性陰莖包皮環(huán)切術(shù)后包皮（取自廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科門(mén)診手術(shù)室）采用組織消化法培

5、養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞。
　　2.分組:
　　假照射組:為正常的培養(yǎng)細(xì)胞，與照射組同樣處理后置于照射裝置下進(jìn)行假照射;
　　低劑量照射組:(1)低劑量照射A組:每天以單次劑量分別為7.2 J/cm2、14.4 J/cm2、21.6 J/cm2、28.8 J/cm2、36 J/cm2照射進(jìn)行照射;(2)低劑量照射B組:每天以劑量為7.2 J/cm2進(jìn)行照射，累積劑量分別為7.2 J/cm2、14.4 J/cm2、21.6 J

6、/cm2、28.8J/cm2、36 J/cm2。
　　高劑量照射組:(1)高劑量照射A組:每天以單次劑量分別為7.2 J/cm2、14.4 J/cm2、21.6 J/cm2、28.8 J/cm2、36 J/cm2照射后，隨后以86.4J/cm2UVA照射細(xì)胞。(2)高劑量照射B組:每天為先以累積劑量分別為7.2 J/cm2、14.4 J/cm2、21.6 J/cm2、28.8 J/cm2、36 J/cm2低劑量UVA預(yù)照射后，再以

7、86.4J/cm2UVA照射細(xì)胞。
　　3.運(yùn)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察MDC染色后各組細(xì)胞內(nèi)自噬形態(tài)及數(shù)量的變化，對(duì)比不同組細(xì)胞的自噬形態(tài)及數(shù)量的差異;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1自噬陽(yáng)性表達(dá)百分比。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)。方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行雙因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

8、結(jié)果:
　　1.組織消化法培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞24h內(nèi)貼壁，剛開(kāi)始貼壁時(shí)細(xì)胞多數(shù)呈圓形，隨貼壁時(shí)間延長(zhǎng)逐漸伸展成梭形或多邊形。5-6天進(jìn)行傳代，傳代后約5天長(zhǎng)滿(mǎn)。取第3-10代人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.采用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察，假照射組的細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率在1d、2d、3d、4d、5d時(shí)分別為4.333±0.577、4.333±1.528、5.000±1.155、7.000±1.000、5.333±1.15

9、5，假照射組組內(nèi)的細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)顯著差異(P＞0.05);低劑量照射A組的細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率在1d、2d、3d、4d、5d時(shí)分別為13.677±1.528、37.333±1.528、57.333±2.082、79.333±1.528、36.330±1.528，與假照射組相比較有顯著差異(P＜0.01);低劑量照射B組的細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率在1d、2d、3d、4d、5d時(shí)分別為13.677±1.284、32.000±2.000、

10、46.677±1.528、57.000±2.000、30.000±1.000,與假照射組相比較有顯著差異(P＜0.01);低劑量照射A組和低劑量照射B組的細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率均隨著照射劑量的增加而增加，但在28.8 J/cm2后細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率出現(xiàn)減少，低劑量照射A組細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率比低劑量照射B組高，低劑量照射A組與低劑量照射B組相比較有顯著差異(P＜0.01)。高劑量照射A組的細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率在1d、2d、3d、4d、5

11、d時(shí)分別為29.360±2.020、80.130±3.096、45.140±1.845、19.630±0.772、7.537±0.463，與假照射組相比較有顯著差異(P＜0.01);高劑量照射B組的細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率在1d、2d、3d、4d、5d時(shí)分別為29.360±2.020、35.850±1.513、56.100±1.365、76.000±1.579、31.440±1.662，與假照射組相比較有顯著差異(P＜0.01);高劑量照射

12、A組在14.4 J/cm2接受86.4J/cm2照射后，細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率出現(xiàn)減少，高劑量照射B組細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率在28.8 J/cm2接受86.4J/cm2照射后出現(xiàn)減少，高劑量照射A組與高劑量照射B組相較有顯著差異(P＜0.01)。
　　3.與細(xì)胞自噬體陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)結(jié)果相一致，低劑量照射A組和低劑量照射B組的Beclin1、LC3表達(dá)均隨著照射劑量的增加而升高，但在28.8 J/cm2后Beclin1、LC3表達(dá)水平下

13、降，低劑量照射A組Beclin1、LC3表達(dá)水平均比低劑量照射B組高，低劑量照射A組與低劑量照射B組相比較有顯著差異(P＜0.01);高劑量照射A組與高劑量照射B組相比，高劑量照射A組Beclin1、LC3表達(dá)很快達(dá)到高峰值然后迅速下調(diào)，而高劑量照射B組Beclin1、LC3表達(dá)仍能慢慢隨著劑量的累積而增加高峰值才出現(xiàn)下調(diào)。高劑量照射A組與高劑量照射B組相比較有顯著差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.低劑量UVA照射