R-Ras與C3G的相互作用及生物學意義的研究.pdf

1、R-Ras屬于Ras家族小分子量G蛋白，與Ras具有55％的氨基酸序列相似性，R-Ras和Ras家族的其他成員一樣,結合GTP時處于激活狀態(tài)，并通過其下游效應物，將胞外信號轉導到胞內，調節(jié)細胞的生物學功能。C3G為Rap1的特異性的鳥苷酸交換因子,近年的研究表明C3G能與R-Ras相互作用。本研究的前期工作也表明全長的C3G能與R-Ras相互作用，而C端催化結構域與R-Ras相互作用較弱。為了進一步研究R-Ras與C3G的相互作用極其兩

2、者相互作用的生物學意義，首先檢測了R-Ras與C3G缺失C末端催化結構域的缺失突變體C3GdelC的體外相互作用，通過在HEK293中瞬時轉染C3GdelC，收獲其蛋白并將其與外源表達GST-R-Ras進行GST-pull down及Western blot，結果表明R-Ras與C3GdelC在體外是相互作用的。同時將R-Ras與C3GdelC共轉染HEK293細胞，通過免疫共沉淀及Western blot檢測出在細胞內R-Ras與C3

3、GdelC也是相互作用的。接著通過Overlay的方法，研究了R-Ras與C3GdelC相互作用的作用方式，將轉移到PVDF膜上的細胞內表達的C3GdelC與外源表達的GST-R-Ras蛋白共孵育，Western blot的結果表明，GST-R-Ras能與膜結合的C3GdelC相互作用，R-Ras與C3G的相互作用是直接的。最后通過GST-pull down及Western blot的方法，找到了R-Ras與C3G相互作用的最小結構域為

4、第210-406氨基酸殘基。為了研究R-Ras與C3GdelC相互作用的生物學意義，首先將R-Ras與C3GdelC共表達于NIH3T3細胞中，通過細胞免疫熒光實驗研究兩者在細胞中的定位。結果發(fā)現(xiàn)C3GdelC主要分布在細胞質中，少部分在細胞膜上也有分布，而R-Ras主要分布在細胞質、細胞膜，二者主要共定位于胞質和部分質膜區(qū)附近。其次通過GST-RBD-pull down實驗對R-Ras進行活性化分析，結果表明C3GdelC能促進R-R