Apelin受體與G蛋白相互作用關(guān)系的研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor, GPCRs）是迄今發(fā)現(xiàn)的最大的膜整合蛋白受體超家族之一，廣泛分布于人體的各個(gè)組織器官中，參與縱多的生理病理反應(yīng)，是重要的藥物靶點(diǎn)。GPCRs主要通過激活G蛋白調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子而參與某些生理病理反應(yīng)，因此受體與蛋白的相互作用是整個(gè)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，GPCRs激活G蛋白后，Gα-GTP與Gβγ亞基相互分離，被激活的Gα亞基通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的某

2、些生理反應(yīng)。近期研究表明，GPCRs和G蛋白存在多種偶聯(lián)關(guān)系，GPCRs不僅能夠選擇性地激活Gα亞基，還可以與Gβγ亞基相互靠近，甚至?xí)笹蛋白亞基構(gòu)象發(fā)生重排而不分離，這為進(jìn)一步研究受體與蛋白的相互作用關(guān)系提供了新思路。
　　Apelin受體（putative receptor protein related to AT1，APJ）是1993年O’Dowd等發(fā)現(xiàn)的孤兒GPCRs，廣泛分布于血管系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)，成為治療缺血性心

3、臟病、原發(fā)性高血壓、心力衰竭等最具潛力的藥物靶點(diǎn)之一。Apelin受體作為GPCRs家族中的一員，也主要是通過偶聯(lián)G蛋白進(jìn)而參與調(diào)節(jié)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的。那么，Apelin受體會(huì)激活哪種類型的G蛋白、引起G蛋白的活化方式是怎樣的以及會(huì)對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生怎樣的影響，至今還不清楚。
　　熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer technology,FRET）與生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技

4、術(shù)（bioluminescence resonance energytransfertechnology, BRET）是近幾十年發(fā)展起來的用于研究活細(xì)胞中大分子之間相互作用的新技術(shù)。利用FRET與BRET技術(shù)能夠在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測Apelin受體偶聯(lián)G蛋白的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，這為實(shí)驗(yàn)的順利開展提供了有力的研究手段。
　　本課題旨在研究Apelin受體與G蛋白的相互作用關(guān)系。試圖探明由APJ受體介導(dǎo)激活的G蛋白的活化機(jī)制，即

5、Gα亞基與Gβγ亞基彼此分離亦或G蛋白構(gòu)象發(fā)生重排而不分離。為Apelin受體參與的相關(guān)生理功能及多種疾病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為相關(guān)藥物的研發(fā)提供新的作用靶點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建 Apelin受體與各亞型G蛋白的多種表達(dá)載體，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎（human embryonic kidkey, HEK293）細(xì)胞，建立共表達(dá)Apelin受體與某一亞型G蛋白的細(xì)胞系。然后通過FRET與BRET技術(shù)研究Apelin受體與各亞基之間

6、的相互作用關(guān)系，即采用FRET與BRET技術(shù)在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測Apelin受體介導(dǎo)激活的Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo與Gαq蛋白的活化機(jī)制。首先利用FRET與BRET技術(shù)在HEK293T細(xì)胞中研究Apelin受體介導(dǎo)激活的Gαi1蛋白的活化機(jī)制，加入激動(dòng)劑Apelin-13刺激后，F(xiàn)RET與BRET信號(hào)幾乎沒有變化。其次利用FRET與BRET技術(shù)在HEK293T細(xì)胞中繼續(xù)探討由Apelin-13誘導(dǎo)激活的Gαi2與Gαi

7、3蛋白的活化，當(dāng)加入激動(dòng)劑Apelin-13刺激后，F(xiàn)RET與BRET數(shù)值發(fā)生明顯的上升現(xiàn)象。進(jìn)一步檢測其它亞家族的G蛋白活化時(shí)是否與Gαi2、Gαi3亞基活化一致，即利用FRET與BRET技術(shù)繼續(xù)探討了Gαo、Gαq與Gβ1γ2的相互作用關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，加入激動(dòng)劑Apelin-13刺激后，F(xiàn)RET與BRET信號(hào)與Gαi2、Gαi3亞基相反，出現(xiàn)了降低的現(xiàn)象。
　　通過實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了由APJ受體激活的Gαi2、Gαi3亞型的G蛋白