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文檔簡介
1、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCRs)是迄今發(fā)現(xiàn)的最大的膜整合蛋白受體超家族之一,廣泛分布于人體的各個組織器官中,參與縱多的生理病理反應,是重要的藥物靶點。GPCRs主要通過激活G蛋白調節(jié)下游信號分子而參與某些生理病理反應,因此受體與蛋白的相互作用是整個跨膜信號轉導的關鍵。傳統(tǒng)觀點認為,GPCRs激活G蛋白后,Gα-GTP與Gβγ亞基相互分離,被激活的Gα亞基通過信號轉導進一步調節(jié)細胞內(nèi)的某
2、些生理反應。近期研究表明,GPCRs和G蛋白存在多種偶聯(lián)關系,GPCRs不僅能夠選擇性地激活Gα亞基,還可以與Gβγ亞基相互靠近,甚至會使G蛋白亞基構象發(fā)生重排而不分離,這為進一步研究受體與蛋白的相互作用關系提供了新思路。
Apelin受體(putative receptor protein related to AT1,APJ)是1993年O’Dowd等發(fā)現(xiàn)的孤兒GPCRs,廣泛分布于血管系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng),成為治療缺血性心
3、臟病、原發(fā)性高血壓、心力衰竭等最具潛力的藥物靶點之一。Apelin受體作為GPCRs家族中的一員,也主要是通過偶聯(lián)G蛋白進而參與調節(jié)下游信號轉導通路的。那么,Apelin受體會激活哪種類型的G蛋白、引起G蛋白的活化方式是怎樣的以及會對信號轉導產(chǎn)生怎樣的影響,至今還不清楚。
熒光共振能量轉移技術(fluorescence resonance energy transfer technology,FRET)與生物發(fā)光共振能量轉移技
4、術(bioluminescence resonance energytransfertechnology, BRET)是近幾十年發(fā)展起來的用于研究活細胞中大分子之間相互作用的新技術。利用FRET與BRET技術能夠在活細胞中實時、動態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測Apelin受體偶聯(lián)G蛋白的動力學關系,這為實驗的順利開展提供了有力的研究手段。
本課題旨在研究Apelin受體與G蛋白的相互作用關系。試圖探明由APJ受體介導激活的G蛋白的活化機制,即
5、Gα亞基與Gβγ亞基彼此分離亦或G蛋白構象發(fā)生重排而不分離。為Apelin受體參與的相關生理功能及多種疾病的發(fā)病機制提供實驗依據(jù),為相關藥物的研發(fā)提供新的作用靶點。
本實驗通過構建 Apelin受體與各亞型G蛋白的多種表達載體,通過瞬時轉染人胚腎(human embryonic kidkey, HEK293)細胞,建立共表達Apelin受體與某一亞型G蛋白的細胞系。然后通過FRET與BRET技術研究Apelin受體與各亞基之間
6、的相互作用關系,即采用FRET與BRET技術在活細胞內(nèi)實時、動態(tài)地監(jiān)測Apelin受體介導激活的Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo與Gαq蛋白的活化機制。首先利用FRET與BRET技術在HEK293T細胞中研究Apelin受體介導激活的Gαi1蛋白的活化機制,加入激動劑Apelin-13刺激后,F(xiàn)RET與BRET信號幾乎沒有變化。其次利用FRET與BRET技術在HEK293T細胞中繼續(xù)探討由Apelin-13誘導激活的Gαi2與Gαi
7、3蛋白的活化,當加入激動劑Apelin-13刺激后,F(xiàn)RET與BRET數(shù)值發(fā)生明顯的上升現(xiàn)象。進一步檢測其它亞家族的G蛋白活化時是否與Gαi2、Gαi3亞基活化一致,即利用FRET與BRET技術繼續(xù)探討了Gαo、Gαq與Gβ1γ2的相互作用關系。研究發(fā)現(xiàn),加入激動劑Apelin-13刺激后,F(xiàn)RET與BRET信號與Gαi2、Gαi3亞基相反,出現(xiàn)了降低的現(xiàn)象。
通過實驗充分證實了由APJ受體激活的Gαi2、Gαi3亞型的G蛋白
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