TEM8與uPA的相互作用及其生物學(xué)意義研究.pdf

1、血管生成是從組織中已存在的成熟血管發(fā)展形成新的毛細血管網(wǎng)絡(luò)的過程,在包括胚胎發(fā)育、傷口愈合、組織再生和重塑等許多重要的生理過程是必不可少的。然而失控的或有缺陷的血管生成也存在于各種疾病,包括腫瘤、心血管疾病以及增生性視網(wǎng)膜疾病的病理過程中。靶向血管生成療法可以被用來終止或延緩這些疾病的發(fā)展,所以這種治療方法已經(jīng)引起了科學(xué)界極大的關(guān)注。然而在臨床應(yīng)用中靶向血管生成的抗腫瘤藥物被證明只有有限的療效,同時還存在很大的副作用,于是尋找更特異性的

2、血管生成標(biāo)志物變得更加迫切。腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物Ⅷ(tumor endothelial marker 8,TEM8)是一種特異性表達于腫瘤脈管系統(tǒng)且物種間高度保守的Ⅰ型膜蛋白。后來的研究發(fā)現(xiàn)TEM8是炭疽毒素保護性抗原(PA)的受體,作為炭疽毒素的“幫兇”,介導(dǎo)其進入宿主細胞。關(guān)于TEM8生理功能方面的研究則相對滯后了很多,僅有一些研究發(fā)現(xiàn)TEM8在腫瘤細胞的遷移、粘附和腫瘤血管生成等生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,tem8基因敲除小鼠實驗也證明T

3、EM8對促進腫瘤血管生成和腫瘤生長起到重要作用,而對正常的生長發(fā)育和傷口愈合沒有任何影響。TEM8這種特異性的分布以及在正常和腫瘤血管形成中功能的差異性,引起了極大關(guān)注。在最近的一篇臨床前研究中發(fā)現(xiàn),靶向TEM8胞外結(jié)構(gòu)域的抗體能夠抑制腫瘤血管的生成以及多種植入到小鼠體內(nèi)的人腫瘤細胞的生長和遷移,這種抗TEM8抗體能夠增強其他抗血管生成劑、血管靶向劑以及傳統(tǒng)化療藥物的活性,并且沒有發(fā)現(xiàn)其存在細胞毒性。
　　本課題組在前期工作中開發(fā)

4、了一種抗體樣分子TEM8-Fc(TEM8N端與炭疽毒素保護性抗原PA結(jié)合的vWA結(jié)構(gòu)域和IgG1Fc段組成的融合蛋白),發(fā)現(xiàn)它是一種具有抗血管生成能力的分子,能抑制多種腫瘤細胞的生長、遷移以及腫瘤血管的生成,然而其抑制腫瘤的機制尚未闡述清楚。為了弄清TEM8-Fc的抑瘤機制,首先需要弄清TEM8的生理性配體及其發(fā)揮生理功能的作用機制。本研究將研究焦點首先集中在關(guān)于TEM8生理性配體的研究上,因為只有找到它的生理性配體才能進一步闡明它在細

5、胞生理條件下的功能作用,為靶向TEM8的腫瘤抗血管生成療法提供理論依據(jù)。在找到TEM8的生理性配體后,又進一步研究了TEM8-Fc抗腫瘤血管生成的機制以及TEM8發(fā)揮生物學(xué)功能的機制。
　　在研究中我們得出了如下結(jié)論:
　　1.通過軟瓊脂克隆形成實驗發(fā)現(xiàn),TEM8和CMG2(特別是TEM8)能夠使HEK293細胞的軟瓊脂克隆形成能力增加,即過表達TEM8或CMG2使HEK293細胞具有了惡性轉(zhuǎn)化的特征。通過CCK8細胞增殖實

6、驗和劃痕實驗等驗證了TEM8和CMG2的部分生理功能:TEM8促進細胞遷移,而CMG2促進細胞增殖。
　　2.利用本課題組前期構(gòu)建的抗體樣分子TEM8-Fc與人肝癌組織勻漿液進行免疫共沉淀和SDS-PAGE電泳,把共沉下的蛋白條帶經(jīng)生物質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了TEM8的兩個可能的相互作用蛋白——尿型纖溶酶原激活劑(uPA)與α-烯醇化酶(α-enolase)。因為uPA是胞外可溶性的信號分子,而α-enolase主要在胞內(nèi)和胞膜上發(fā)揮功能,

7、所以推測uPA即是TEM8的生理性配體,于是下一步工作主要圍繞uPA與TEM8展開。為了進一步確定兩者之間的相互作用,我們先后用ELISA、Western Blot等方法進行了驗證,并且通過表面等離子體共振(SPR)的方法測定了TEM8-Fc與uPA的結(jié)合常數(shù)。TEM8-Fc結(jié)合到高分子量單鏈uPA(HMW-scuPA),高分子量雙鏈uPA(HMW-tcuPA)和低分子量uPA(LMW-uPA)的結(jié)合常數(shù)分別為16.6nM,29.7nM

8、和31.1nM。另外還通過溶圈實驗和S2444發(fā)色底物法發(fā)現(xiàn)與TEM8的結(jié)合不會影響uPA的酶活性。
　　3.構(gòu)建了uPA的幾種截短突變體與EGFP的融合蛋白表達載體,同時構(gòu)建了TEM8胞外區(qū)(N端)與RFP的融合蛋白表達載體,然后將各種uPA截短突變體與EGFP的融合蛋白表達載體和TEM8胞外區(qū)(N端)與RFP的融合蛋白表達載體分別共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中。最后通過FRET的方法確定了uPA與TEM8之間的相互作用區(qū)域。FRE

9、T的結(jié)果顯示uPA的Kringle區(qū)和酶活性區(qū)的C端與TEM8的N端有FRET效應(yīng),即介導(dǎo)uPA與TEM8相互作用區(qū)域是它的Kringle結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的C-末端。因此uPA與TEM8相互作用區(qū)域不同于uPA受體(uPAR)(uPA的EGF樣結(jié)構(gòu)域負責(zé)與uPAR相互作用)。
　　4.用IP的方法證明了uPA能夠劑量依賴性的使TEM8磷酸化,而TEM8-Fc可拮抗uPA導(dǎo)致的TEM8磷酸化。通過Raybiotech公司的RTK磷

10、酸化芯片和EGFR磷酸化位點芯片,發(fā)現(xiàn)uPA能夠上調(diào)EGFR845位和1173位酪氨酸的磷酸化水平,而TEM8-Fc能拮抗它的作用。在細胞生物學(xué)方面研究了TEM8與uPA的相互作用對腫瘤生長和遷移的作用,通過遷移實驗發(fā)現(xiàn)uPA能夠顯著地增加HepG2細胞的uPAR非依賴性的遷移,而TEM8-Fc能夠封閉uPA的作用。最后觀察到本組開發(fā)的兩種抗體樣分子TEM8-Fc和ATF-Fc具有協(xié)同抗腫瘤的作用。
　　綜上所述,本研究結(jié)果表明T