c-Abl非受體酪氨酸激酶與U2AF65相互作用及其生物學(xué)意義.pdf

1、c-Abl是Abelson小鼠白血病病毒原癌基因v-abl在細(xì)胞內(nèi)的同源基因,所編碼的蛋白c-Abl屬于非受體酪氨酸激酶,在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布,具有重要的生物學(xué)功能。c-Abl通過與其底物相互作用,并使其相互作用蛋白酪氨酸磷酸化而激活一系列重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,參與調(diào)控細(xì)胞黏附遷移、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等過程。c-Abl在DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用;c-Abl在RNA轉(zhuǎn)錄后加工過程中也發(fā)

2、揮著重要的調(diào)節(jié)作用。至今,c-Abl具體的下游因子及分子機(jī)制知之甚少。
　　為進(jìn)一步研究c-Abl發(fā)揮功能的分子機(jī)理,實(shí)驗(yàn)室前期以全長(zhǎng)c-Abl為誘餌蛋白,采用酵母雙雜交法篩選Hela細(xì)胞cDNA庫,獲得一系列與c-Abl相互作用的靶分子,發(fā)現(xiàn)剪接因子U2AF65(U2 snRNP auxiliary factor65kDa subunit)可能與c-Abl相互作用。U2AF65作為重要的mRNA剪接因子,它與前體mRNA內(nèi)含子多

3、聚嘧啶區(qū)的特異結(jié)合是起始剪接體組裝的關(guān)鍵步驟,同時(shí)它也參與可變剪接的調(diào)節(jié)和mRNA核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。U2AF65的RS結(jié)構(gòu)域與前體mRNA內(nèi)含子分支位點(diǎn)BPS交叉連接,使U2snRNP中的snRNA更容易與BPS結(jié)合;該結(jié)構(gòu)域也作為核定位信號(hào),在亞細(xì)胞定位和核質(zhì)穿梭中起到重要的決定作用。RRM結(jié)構(gòu)域識(shí)別pre-mRNA內(nèi)含子中主要由尿嘧啶組成的多聚嘧啶序列Py-tract。UHM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用。U2AF65的Lys15和Lys2

4、76可以發(fā)生酰羥基化并影響U2AF65的活性,進(jìn)而引發(fā)某些基因的可變剪接。至今,有關(guān)U2AF65調(diào)控的研究甚少。
　　本論文在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)非受體酪氨酸激酶c-Abl與U2AF65相互作用及其在核質(zhì)穿梭、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn),可變剪接等過程中的作用進(jìn)行了研究。
　　本研究通過免疫沉淀、免疫印跡及GST-pull down方法證明c-Abl和U2AF65在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外直接相互作用。c-Abl通過SH2、SH3結(jié)構(gòu)域與U2

5、AF65直接結(jié)合。通過GST-pull down和點(diǎn)突變的方法發(fā)現(xiàn)與c-Abl結(jié)合的結(jié)構(gòu)域是UHM結(jié)構(gòu)域,參與結(jié)合的氨基酸殘基主要包括第414、416和423位脯氨酸。通過抗酪氨酸磷酸化抗體的免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明c-Abl可以使U2AF65酪氨酸磷酸化,U2AF65是非受體酪氨酸激酶c-Abl的磷酸化底物,但是磷酸化較弱;利用質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)U2AF65可能的磷酸化位點(diǎn)是第91位和第232位酪氨酸。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)c-Abl基本不影響U2AF6

6、5的表達(dá)。U2AF65是核質(zhì)穿梭蛋白,但通常在熒光顯微鏡下它只在細(xì)胞核中被觀察到。用5、10、15Gy劑量電離輻射處理細(xì)胞,DNA損傷應(yīng)激條件下,U2AF65由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移的程度具有劑量依賴性。隨著時(shí)間的推移,U2AF65又由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。當(dāng)用c-Abl抑制劑STI571處理細(xì)胞,無論是出核還是之后的入核都被抑制。當(dāng)使用缺失c-Abl激酶活性的MCF-7(c-Abl K290R)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)U2AF65更多地定位在細(xì)胞質(zhì)

7、中,以15Gy劑量的電離輻射處理之后,也沒有出現(xiàn)核質(zhì)之間的轉(zhuǎn)移,說明U2AF65在細(xì)胞內(nèi)的分布和c-Abl的活性相關(guān)。c-Abl調(diào)控電離輻射介導(dǎo)的U2AF65的核質(zhì)間的穿梭。核質(zhì)之間的穿梭通常與蛋白的核定位信號(hào)(NLS)和核輸出信號(hào)(NES)有關(guān),CRM1,即exportin1,是主要的出核介導(dǎo)物。它與出核蛋白上的NES序列結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至核孔的出核部分。Leptomycin B(LMB)可特異阻斷CRM1識(shí)別NES信號(hào)從而阻斷蛋白質(zhì)核

8、輸出過程。我們發(fā)現(xiàn),15Gy劑量輻射處理細(xì)胞的同時(shí)再加LMB處理2h,U2AF65沒有完全從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入細(xì)胞質(zhì),部分滯留在細(xì)胞核。說明U2AF65蛋白自身可能含有NES信號(hào)。經(jīng)過對(duì)U2AF65氨基酸序列的分析,在U2AF65的RRM2結(jié)構(gòu)域和UHM結(jié)構(gòu)域之間,發(fā)現(xiàn)一段疑似NES的特征性序列374-LCLMNMVLP-382。瞬間異核體形成實(shí)驗(yàn)證明U2AF65的NES介導(dǎo)其出核。同時(shí)發(fā)現(xiàn),電離輻射可調(diào)控U2AF65介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)運(yùn),在細(xì)

9、胞接受電離輻射不同時(shí)間(2h、4h)后,細(xì)胞質(zhì)中HEXIM和ZNF174基因的mRNA(其核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)由 U2AF65介導(dǎo))水平均升高。由于而這兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄抑制因子,說明c-Abl可能通過調(diào)控這類轉(zhuǎn)錄因子的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。
　　最后,我們通過Affymetrix外顯子芯片,發(fā)現(xiàn)c-Abl廣泛參與的轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控。由Partek軟件分析輸出差異表達(dá)基因列表,和可能發(fā)生可變剪接的基因和位點(diǎn),大量基因發(fā)生了受調(diào)控的可

10、變剪接。
　　本研究通過c-Abl與U2AF65的相互作用及生物學(xué)意義研究得到如下結(jié)果:
　　c-Abl能夠直接與U2AF65相互作用;c-Abl與U2AF65UHM結(jié)構(gòu)域的第414-423位氨基酸殘基結(jié)合;c-Abl能夠使U2AF65磷酸化,酪氨酸磷酸化位點(diǎn)分析表明U2AF65的Y91和Y232可能是磷酸化位點(diǎn);c-Abl基本不影響U2AF65的表達(dá);U2AF65是核質(zhì)間穿梭蛋白,其核-質(zhì)穿梭受c-Abl依賴的電離輻射調(diào)控

11、;U2AF65具有NES核輸出信號(hào),特征性序列為L(zhǎng)CLMNMVLP;電離輻射調(diào)控U2AF65介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)運(yùn);c-Abl廣泛調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和可變剪接。
　　通過c-Abl與U2AF65的相互作用及其生物學(xué)意義的研究,證明c-Abl非受體酪氨酸激酶與剪接因子U2AF65存在相互作用,并對(duì)c-Abl酪氨酸激酶調(diào)節(jié)U2AF65的核質(zhì)穿梭和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn),c-Abl參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄和可變剪接的機(jī)制進(jìn)行了探討。對(duì)深入認(rèn)識(shí)c-Abl酪氨酸激酶在生理