DEDD與Smad3相互作用負性調控TGF-β介導的生物學活性.pdf

1、轉化生長因子β（TGF-β）是一類對細胞增殖、分化、遷移、凋亡以及細胞外基質形成、血管形成、免疫、發(fā)育均發(fā)揮調節(jié)作用的分泌型細胞因子。該家族調節(jié)異?？梢詫е赂鞣N疾病發(fā)生，例如腫瘤、纖維化、自身免疫性疾病以及血管性疾病等。TGF-β家族發(fā)揮其生物學功能主要通過Smads蛋白，Smads是TGF-β家族細胞內信號傳導分子。目前在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)八種Smads蛋白，根據(jù)功能不同可分為三類：受體激活型Smads、通用介質型Smads、抑制型S

2、mads。TGF-β信號在整個傳遞過程中均受到不同層面的調節(jié)，因此TGF-β家族具有生物功能多樣性。細胞內多種蛋白都可與Smads相互作用，這可以促進TGF-β信號與其他信號途徑發(fā)生“整合”。
　　 死亡受體結構域（Death effector domains，DEDs）是蛋白發(fā)生相互作用的區(qū)域，含有DED的蛋白可以介導由死亡受體觸發(fā)的程序性細胞死亡或凋亡。DED本身沒有酶活性而是作為其他DEDs的結合區(qū)域，因而促進蛋白復合體形

3、成。FADD、caspase8以及DEDD均屬于含有DED結構域的蛋白。研究表明，DEDD通過活化caspase3或capase6在CD95介導的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。近來發(fā)現(xiàn)DEDD也參與細胞周期調控并抑制有絲分裂進程。然而，關于DEDD是否通過與關鍵的蛋白相互作用參與其他信號轉導途徑以及DEDD本身生物學功能尚未清楚。
　　 我們實驗室前期以全長的Smad3蛋白為“釣餌”，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出DEDD與Smad3相互作

4、用。本次研究中，我們應用免疫共沉淀和GST-pull down方法均證明DEDD與Smad3可以發(fā)生相互作用，這是首次報道Smad3與含有DED結構域蛋白之間的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)TGF-β可以下調DEDD與Smad3的結合，而且DEDD與磷酸化的Smad3結合能力減弱。雙熒光素酶報告基因實驗證明DEDD通過其DED結構域可以抑制TGF-β/Smad3介導的轉錄活性，而且Smad3可以協(xié)同增強DEDD對NF-KB基因的轉錄。細胞免疫熒光染

5、色和Western blotting實驗證明DEDD可以抑制Smad3入核作用。免疫沉淀實驗證明DEDD可以抑制Smad3磷酸化以及Smad3與Smad4復合體形成作用。Western blotting和RT-PCR實驗證明DEDD抑制TGF-β靶基因的轉錄和翻譯，而且TGF-β抑制DEDD蛋白表達和基因轉錄。細胞劃痕實驗和Transwell實驗證明DEDD抑制TGF-β介導的細胞遷移和侵襲作用，而且DEDD本身也具有抑制細胞遷移和侵襲