2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年人群中最常見(jiàn)的一種神經(jīng)退行性疾病,其主要病理特征是β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)在神經(jīng)細(xì)胞外的沉積。探究Aβ生成增多的原因?qū)D的預(yù)防和治療有重要意義。
   Aβ是β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein, AβPP)經(jīng)β-位點(diǎn)AβPP內(nèi)切酶(beta-site amyloid precursor p

2、rotein cleaving enzyme1,BACE1)作用裂解產(chǎn)生的。研究表明,腦膽固醇或腦細(xì)胞中膽固醇的增加是引發(fā)腦Aβ生成的重要原因。增加神經(jīng)細(xì)胞中的膽固醇能夠使BACE1的活性增高,導(dǎo)致Aβ生成增加,相反,降低細(xì)胞中的膽固醇,Aβ的生成減少。
   血膽固醇的改變也能影響腦Aβ的生成。高脂飲食誘導(dǎo)AβPP轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生高膽固醇血癥,可使腦Aβ斑塊樣沉積增加;而給予降膽固醇藥物降低血膽固醇后,Aβ含量減少。已知,膽固醇

3、不能通過(guò)正常的血腦屏障,那么,非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的血膽固醇影響腦Aβ生成是否與腦膽固醇有關(guān)呢?
   促黃體生成激素(luteinizing Hormone,LH)是下丘腦-垂體-性腺軸中最重要的激素之一。新近發(fā)現(xiàn),LH在AD患者的血中、腦中的濃度都明顯高于同齡的正常人;用LH處理人神經(jīng)元細(xì)胞后,BACE1活性和Aβ的生成均明顯增加。已知,LH與性腺的LH受體結(jié)合后可調(diào)節(jié)其中的膽固醇合成增加。大腦也存有LH受體,LH是否也可通過(guò)調(diào)節(jié)腦

4、細(xì)胞的膽固醇引起Aβ生成增加?目前尚無(wú)報(bào)道。
   為此,本課題分別用高膽固醇飲食增加Wistar大鼠血膽固醇的水平(第一部分),他汀類藥物降低大鼠血膽固醇水平(第二部分),以及用LH處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤M17細(xì)胞(第三部分),導(dǎo)致腦和細(xì)胞中Aβ的生成改變后,觀察此時(shí)腦或細(xì)胞中膽固醇的變化,以分析膽固醇在不同因素引起的Aβ生成中的作用。
   第一部分、高膽固醇血癥增加腦Aβ的水平但不改變腦膽固醇含量
   目的:用

5、高脂飲食增加Wistar大鼠血膽固醇的水平,導(dǎo)致腦中Aβ的生成改變后,觀察腦膽固醇的變化,探討腦膽固醇在血膽固醇引起Aβ生成中的作用。
   方法:成年雄性Wistar大鼠共18只,隨機(jī)分為普通飲食組(NC)和高膽固醇飲食組(HCC,含2%膽固醇、10%豬油),每組9只,飼養(yǎng)13周。血清用于血膽固醇濃度測(cè)定;大腦組織用于腦膽固醇測(cè)定、總RNA提取和腦Aβ含量測(cè)定。
   結(jié)果:
   1.高膽固醇飲食增加了血膽固

6、醇濃度
   用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇濃度。高膽固醇飲食組大鼠的血膽固醇水平明顯高于普通飲食組(3.15±0.62mmol/l vs1.62±0.10mmol/l,p<0.001)。表明高膽固醇飲食導(dǎo)致了大鼠的高膽固醇血癥。
   2.高血膽固醇水平的增加了腦Aβ水平
   用放免法測(cè)定腦Aβ水平。高膽固醇血癥大鼠腦Aβ顯著高于NC組(315.23±73.06pg/mg protein vs266.01±

7、36.41pg/mg protein,p<0.05)。腦中Aβ的含量與血總膽固醇水平呈顯著正相關(guān)(r=0.89,r2=0.78,p<0.001)。表明,血總膽固醇的增加使腦Aβ的含量增加。
   3.高血膽固醇不影響腦總膽固醇的含量
   用膽固醇氧化酶-過(guò)氧化物酶法測(cè)定腦總膽固醇含量。高膽固醇血癥大鼠與NC組相比較,腦中的總膽固醇水平的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5.96±1.26mg/10gvs6.08±0.51mg/10g,

8、p>0.05)。表明,血膽固醇的增加不影響腦總膽固醇的含量。
   4.高血膽固醇不影響腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)
   用RT-PCR法測(cè)定腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)。高膽固醇血癥大鼠與NC組相比較,腦中膽固醇合成的關(guān)鍵酶HMGCoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)mRNA(0.58±0.05vs0.54±0.03,p>0.05)和參

9、與腦膽固醇轉(zhuǎn)化的24S-羥化酶(cholesterol24-hydroxylase,CYP46)mRNA(0.57±0.01vs0.61±0.02,p>0.05)的表達(dá)水平的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明,血膽固醇的增加不影響腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá),從而進(jìn)一步證明血膽固醇的增加不影響腦總膽固醇水平。
   小結(jié):
   1.腦Aβ的水平隨血膽固醇的增加呈正相關(guān)改變。
   2.血膽固醇增高使腦Aβ水平增加是

10、腦膽固醇非依賴性的。
   第二部分、血膽固醇的降低減少腦Aβ的水平但不改變腦膽固醇含量
   目的:用他汀藥物降低Wistar大鼠血膽固醇的水平,導(dǎo)致腦中Aβ的生成改變后,觀察腦膽固醇的變化,探討腦膽固醇在血膽固醇引起Aβ生成中的作用。
   方法:成年雄性Wistar大鼠共20只,隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)和氟伐他汀灌胃組(FV),每組10只,氟伐他汀溶于1%羧甲基纖維素溶液中制成混懸液,按20mg/kg/da

11、y的劑量灌胃,對(duì)照組給予同等劑量1%羧甲基纖維素溶液,連續(xù)灌胃28天。血清用于血膽固醇濃度測(cè)定;大腦組織用于腦膽固醇測(cè)定、總RNA提取、腦Aβ含量測(cè)定和AβPP的免疫組化分析。
   結(jié)果:
   1.氟伐他汀降低了血總膽固醇濃度
   用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇濃度。氟伐他汀灌胃的大鼠,血膽固醇水平明顯低于正常組大鼠(1.13±0.10mmol/1vs1.53±0.13mmol/l,p<0.05)。表明氟

12、伐他汀明顯降低了大鼠血膽固醇的水平。
   2.血膽固醇的降低減少了腦Aβ
   用放免法測(cè)定腦Aβ水平。氟伐他汀處理的大鼠腦Aβ水平明顯低于對(duì)照大鼠組(142.53±27.48pg/mg protein vs213.36±45.21pg/mg protein,p<0.05)。腦中Aβ的含量與血總膽固醇水平呈顯著正相關(guān)(r=0.54,r2=0.24,p<0.05)。表明,血總膽固醇的改變可影響腦Aβ的含量。
  

13、 3.血膽固醇的降低不影響腦總膽固醇的含量
   用膽固醇氧化酶-過(guò)氧化物酶法測(cè)定腦總膽固醇含量。氟伐他汀處理大鼠與Con組相比較,腦中的總膽固醇水平的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(6.32±0.97 vs6.00±0.58,p>0.05)。表明,血膽固醇的降低不影響腦總膽固醇的含量。
   4.血膽固醇的降低不影響腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)
   用RT-PCR法測(cè)定腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)。氟伐他汀

14、處理大鼠與Con組相比較,腦中HMGR(0.57±0.05vs0.53±0.05,p>0.05)和CYP46mRNA(0.88±0.06vs0.99±0.12,p>0.05)表達(dá)水平的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明,血膽固醇的降低不影響腦膽固醇代謝相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá),從而進(jìn)一步證明血膽固醇的降低不影響腦總膽固醇水平。
   5.血膽固醇的降低影響了腦Aβ代謝相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)
   用免疫組化法分析腦AβPP的表

15、達(dá),用RT-PCR法測(cè)定腦Aβ代謝相關(guān)基因蛋白和mRNA的表達(dá)。氟伐他汀處理大鼠,與正常大鼠相比,腦BACE1mRNA的水平(0.15±0.02vs0.30±0.06,p<0.01),大腦皮質(zhì)和海馬中AβPP的蛋白表達(dá)明顯降低;相反,AβPP裂解途徑中不產(chǎn)生Aβ的酶α-分泌酶(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10, ADAM10) mRNA的表達(dá)增加(

16、0.34±0.05vs0.23±0.05,p<0.01)。表明,血膽固醇降低引起的腦Aβ降低與Aβ生成相關(guān)基因表達(dá)的改變有關(guān)。
   小結(jié):
   1.腦Aβ的水平隨血膽固醇濃度的降低呈正相關(guān)改變。
   2.血膽固醇降低減少腦Aβ的生成是腦膽固醇非依賴性的。
   第三部分、LH增加神經(jīng)細(xì)胞Aβ的生成也增加膽固醇的生成
   目的:用LH處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤M17細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞中Aβ的生成改變后,觀

17、察細(xì)胞中膽固醇的變化,探討膽固醇在LH引起的Aβ生成中的作用。
   方法:用LH處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤M17細(xì)胞5天,收集細(xì)胞培養(yǎng)液用于培養(yǎng)液中Aβ含量的測(cè)定;收集細(xì)胞用于Aβ含量、膽固醇含量、以及膽固醇合成、Aβ生成相關(guān)基因的mRNA的測(cè)定。
   結(jié)果:
   1.LH可使M17細(xì)胞及培養(yǎng)液的Aβ增加
   Aβ放免法檢測(cè)結(jié)果顯示,不同劑量的LH處理細(xì)胞后,細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌型的Aβ(0mIU/ml,9.7

18、8±0.22;20mIU/ml,10.48±0.11,p<0.01;40mIU/ml,11.02±0.20,p<0.001;80mIU/ml,11.61±0.28,p<0.001)和細(xì)胞中的Aβ(0mIU/ml,74.02±0.55;20mIU/ml,81.08±3.32,p<0.01;40mIU/ml,85.89±0.63,p<0.001;80mIU/ml,99.06±1.29,p<0.001)含量均明顯增多,且呈劑量依賴性。表明LH

19、能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞中Aβ的生成。
   2.LH使細(xì)胞中膽固醇含量增加
   神經(jīng)細(xì)胞中膽固醇的測(cè)定結(jié)果顯示,LH使細(xì)胞中膽固醇含量增加,且呈劑量依賴(0mIU/ml,0.29±0.02;20mIU/ml,0.32±0.02,p<0.05;40mIU/ml,0.35±0.07,p<0.05;80mIU/ml,0.39±0.06,p<0.001);細(xì)胞中膽固醇含量與細(xì)胞及培養(yǎng)液的總Aβ水平呈正相關(guān)。表明,膽固醇有可能在LH促進(jìn)

20、Aβ生成中發(fā)揮作用。
   3.LH使細(xì)胞中膽固醇合成關(guān)鍵酶HMGR的mRNA表達(dá)增加
   Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,LH處理后,細(xì)胞中HMGRm RNA的表達(dá)增高(0mIU/ml,0.04±0.00;40mIU/ml,0.12±0.01,p<0.05)。表明LH處理后,細(xì)胞膽固醇含量的增加有可能與HMGR的表達(dá)增加有關(guān)。
   4.LH使HMGR的上游調(diào)控因子SREBP2的mRNA表達(dá)增加

21、>   Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,LH處理后,SREBP2的mRNA表達(dá)增加(0mIU/ml,0.11±0.01;40mIU/ml,0.38±0.04,p<0.01)。表明LH處理后,細(xì)胞中HMGR的表達(dá)增加可能與SREBP2的表達(dá)增加有關(guān)。
   5.LH影響M17細(xì)胞中Aβ生成相關(guān)基因的表達(dá)
   Real-time PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示,LH處理后,β-分泌酶裂解途徑中BACE1的mRNA表達(dá)增高(

22、0mIU/ml,0.03±0.00;40mIU/ml,0.04±0.00,p<0.05),而AβPP(0mIU/ml,0.10±0.00;40mIU/ml,0.11±0.00,p>0.05)和α-分泌酶途徑中的ADAM10的mRNA水平?jīng)]有明顯變化(0mIU/ml,0.03±0.00;40mIU/ml,0.02±0.00,p>0.05)。表明LH處理后,Aβ的生成增多與BACE1的mRNA表達(dá)增加有關(guān)。
   小結(jié):LH可能通過(guò)

23、SREBP2-HMGR-膽固醇途徑,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞中膽固醇的合成,從而使細(xì)胞中Aβ生成增加。
   結(jié)論:
   1.腦Aβ水平可以隨血膽固醇的改變而改變,但這種改變是腦膽固醇非依賴性的。
   2.LH使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Aβ增加是膽固醇依賴性的。
   3.引起腦Aβ改變的因素不都與腦膽固醇有關(guān)。
   神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma, NB)是最常見(jiàn)的小兒顱外實(shí)體性惡性腫瘤,由未分化的交感神

24、經(jīng)細(xì)胞組成,惡性程度高,易復(fù)發(fā),預(yù)后差。NB對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致患兒預(yù)后不良的主要原因。探究NB耐藥的具體分子機(jī)制對(duì)NB的治療有重要的指導(dǎo)意義。
   腫瘤抑制因子p53在抑制腫瘤生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮核心作用。細(xì)胞受到如化療藥物等外界因素刺激時(shí),p53被活化,轉(zhuǎn)錄與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)使細(xì)胞凋亡,達(dá)到抑制腫瘤的目的。p53基因突變或活性喪失都可以使腫瘤細(xì)胞抗凋亡,從而導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。
   HDM2是p53主

25、要的負(fù)性調(diào)節(jié)分子,通過(guò)與p53結(jié)合,促進(jìn)p53的降解或抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)抑制p53的功能。HDM2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞,其凋亡力降低,但用nutlin-3抑制該細(xì)胞的HDM2與p53結(jié)合后,細(xì)胞的凋亡能力明顯恢復(fù)。由此推測(cè),HDM2高表達(dá)并與p53的結(jié)合,很可能是細(xì)胞抗凋亡,導(dǎo)致耐藥的原因。
   Noxa是p53的下游基因之一,在廣譜抗腫瘤藥Doxo(Doxorubicin)誘導(dǎo)的NB細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用。如果上述推測(cè)屬實(shí),高

26、表達(dá)的HDM2與p53結(jié)合后,是通過(guò)促進(jìn)p53降解,還是通過(guò)抑制p53/Noxa途徑,使NB細(xì)胞抗凋亡導(dǎo)致耐藥?未見(jiàn)報(bào)道。
   為此,本課題分兩部分,以各種NB細(xì)胞株為研究對(duì)象,首先確定了對(duì)Doxo耐藥的NB細(xì)胞株并觀察HDM2和p53在細(xì)胞中的表達(dá)情況,然后,在Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中敲低HDM2的表達(dá),在Doxo-敏感的NB細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HDM2,觀察HDM2與p53的相互作用,探討了高表達(dá)的HDM2與細(xì)胞抗凋亡,耐藥的關(guān)

27、系,為闡明NB細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制及尋找新的NB的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
   第一部分、HDM2與神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐藥的關(guān)系研究
   目的:確定對(duì)Doxo耐藥的NB細(xì)胞株,觀察HDM2在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況,并通過(guò)在Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中敲低HDM2的表達(dá),在Doxo-敏感的NB細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HDM2等手段,觀察細(xì)胞的凋亡情況,探討高表達(dá)的HDM2與細(xì)胞抗凋亡,產(chǎn)生耐藥的關(guān)系;確定Doxo-耐藥細(xì)胞中HDM2與p53的結(jié)

28、合情況;用MG132抑制蛋白酶體降解蛋白的作用,觀察p53是否被降解,探討HDM2是否通過(guò)促進(jìn)p53降解,使細(xì)胞抗凋亡而產(chǎn)生耐藥。
   方法:分別給予野生型p53的NB細(xì)胞株SK-N-SH,NB-9,NB-19和IMR-32細(xì)胞0.1μg/ml Doxo處理24小時(shí),進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè),確定Doxo-耐藥的NB細(xì)胞株:用western blot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同NB細(xì)胞中HDM2和p53的表達(dá);用表達(dá)人全長(zhǎng)HDM2的慢病

29、毒感染Doxo-敏感的SK-N-SH細(xì)胞,使HDM2在細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá),用0.1μg/mlDoxo處理24小時(shí),subG0/G1檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況;用siRNA敲低野生型p53且Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞以及p53突變的SK-N-DZ細(xì)胞中HDM2的表達(dá),0.1μ,g/mlDoxo處理24小時(shí),DAPI染色后進(jìn)行凋亡形態(tài)分析;對(duì)Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞進(jìn)行HDM2與p53的免疫共沉淀;分別給予Doxo-

30、耐藥的NB-19細(xì)胞,Doxo-敏感的SK-N-SH細(xì)胞和HDM2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的SK-N-SH(即SK1)細(xì)胞MG132處理24小時(shí),western blot檢測(cè)細(xì)胞中p53的蛋白量。
   結(jié)果:
   1.IMR32和NB-19為Doxo-耐藥的NB細(xì)胞株
   Doxo處理后,SK-N-SH和NB-9細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡,而IMR32和NB-19細(xì)胞死亡不明顯。表明SK-N-SH和NB-9為Doxo-敏感細(xì)胞株,

31、而IMR32和NB-19為Doxo-耐藥細(xì)胞株。
   2.HDM2在Doxo-耐藥NB細(xì)胞中高表達(dá)
   Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞中,HDM2mRNA和蛋白水平均明顯高于Doxo-敏感的SK-N-SH和NB-9細(xì)胞。表明HDM2在Doxo-耐藥NB細(xì)胞中高表達(dá)。
   3.HDM2的過(guò)表達(dá)能夠使Doxo-敏感的NB細(xì)胞抗凋亡
   過(guò)表達(dá)外源性HDM2的Doxo-敏感細(xì)胞(SK1,SK

32、2和SK3細(xì)胞)被Doxo處理后,其凋亡率明顯低于未過(guò)表達(dá)HDM2的Doxo-敏感細(xì)胞(SK-N-SH細(xì)胞)。表明,HDM2的過(guò)表達(dá)可以使Doxo-敏感的NB細(xì)胞抗凋亡。
   4.HDM2的表達(dá)降低能夠使Doxo-耐藥的NB細(xì)胞凋亡
   敲低HDM2的Doxo-耐藥細(xì)胞(IMR32和NB-19細(xì)胞)經(jīng)Doxo處理后,其凋亡率明顯高于HDM2未敲低的Doxo-耐藥細(xì)胞(IMR32和NB-19)。表明HDM2的表達(dá)降低可

33、使Doxo-耐藥的NB細(xì)胞發(fā)生凋亡。
   5.p53在Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中高表達(dá)
   在Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞中,p53的mRNA和蛋白水平均明顯高于Doxo-敏感的SK-N-SH和NB-9細(xì)胞。表明,HDM2高表達(dá)的Doxo耐藥細(xì)胞,其p53也高表達(dá)。
   6.高表達(dá)的HDM2導(dǎo)致細(xì)胞耐藥是p53依賴性的
   敲低HDM2的p53野生型Doxo-耐藥細(xì)胞(IMR32和N

34、B-19細(xì)胞)經(jīng)Doxo處理后,其細(xì)胞凋亡率明顯高于未敲低HDM2的Doxo-耐藥細(xì)胞(IMR32和NB-19細(xì)胞);而p53突變的SK-N-DZ細(xì)胞,其凋亡率并沒(méi)有因HDM2的敲低而增加。表明,HDM2表達(dá)降低使Doxo-耐藥的NB細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程是p53依賴的。
   7.HDM2在Doxo-耐藥NB細(xì)胞中與p53相互結(jié)合
   在Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞中,用p53的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí),在沉淀中

35、檢測(cè)到了HDM2的存在;而用HDM2的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí),也能夠在沉淀中檢測(cè)到p53的存在。表明Doxo-耐藥細(xì)胞中的p53確實(shí)是與HDM2相互結(jié)合存在的。
   8.Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中,p53通過(guò)蛋白酶體的降解受到了抑制
   在Doxo-耐藥的NB-19細(xì)胞中,給予蛋白酶體的抑制劑MG132處理后,p53的蛋白水平并沒(méi)有隨MG132的加入而增加。表明Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中,p53并不通過(guò)蛋白酶體而降解。<

36、br>   9.Doxo-敏感的NB細(xì)胞中,p53可通過(guò)蛋白酶體降解
   在Doxo-敏感的SK-N-SH細(xì)胞中,給予蛋白酶體的抑制劑MG132處理后,p53的蛋白含量隨MG132劑量的增加而增加。表明,Doxo-敏感的NB細(xì)胞中,p53可通過(guò)蛋白酶體而降解。
   10.過(guò)表達(dá)HDM2能夠抑制Doxo-敏感的NB細(xì)胞p53經(jīng)蛋白酶體的降解。
   未轉(zhuǎn)染HDM2的Doxo-敏感細(xì)胞(SK-N-SH細(xì)胞),給

37、予蛋白酶體的抑制劑MG132處理后,p53的蛋白含量隨MG132劑量的增加而增加;而HDM2過(guò)表達(dá)后,Doxo-敏感細(xì)胞(SK1細(xì)胞)的p53蛋白含量卻不隨MG132的劑量增加而增加。表明,Doxo-敏感的NB細(xì)胞過(guò)表達(dá)HDM2能夠抑制p53經(jīng)蛋白酶體途徑的降解。
   小結(jié):
   1.野生型p53的Doxo-耐藥NB細(xì)胞,通過(guò)高表達(dá)的HDM2與p53相互作用,繼而抗凋亡,產(chǎn)生耐藥。
   2.野生型p53的D

38、oxo-耐藥NB細(xì)胞中,高表達(dá)的HDM2對(duì)p53的負(fù)性調(diào)節(jié)作用,與蛋白酶體的降解無(wú)關(guān)。
   第二部分、HDM2的高表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐藥的分子機(jī)制
   目的:探討HDM2抑制p53轉(zhuǎn)錄活性致NB細(xì)胞耐藥的機(jī)制。
   方法:用siRNA敲低野生型p53且Doxo-耐藥的IMR32和NB-19細(xì)胞以及p53突變的SK-N-DZ細(xì)胞中HDM2的表達(dá),0.1μg/ml Doxo處理細(xì)胞24小時(shí),western b

39、lot和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中HDM2和Noxa的表達(dá);用表達(dá)人HDM2全長(zhǎng)的慢病毒感染Doxo-敏感的SK-N-SH細(xì)胞,使HDM2在細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá),0.1μg/ml Doxo處理24小時(shí)后,RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中p53下游基因Noxa和p21的表達(dá),westem blot檢測(cè)細(xì)胞中p53,磷酸化p53,Noxa和p21的表達(dá),ChIP和雙熒光素酶檢測(cè)p53與Noxa上游p53順式作用元件的結(jié)合能力。
   結(jié)果:
 

40、  1.HDM2的過(guò)表達(dá)抑制了Doxo-敏感NB細(xì)胞中p53的活化
   Doxo處理后,Doxo-敏感的NB細(xì)胞(SK-N-SH細(xì)胞)中,p53的蛋白量、p53的磷酸化程度、以及p53下游基因p21和Noxa的mRNA和蛋白表達(dá)均被加強(qiáng);而HDM2過(guò)表達(dá)的Doxo-敏感NB細(xì)胞(SK1,SK2和SK3細(xì)胞)中,p53的蛋白量、p53的磷酸化程度,以及p53下游基因p21和Noxa的表達(dá)均沒(méi)有明顯變化。表明HDM2的過(guò)表達(dá)能夠

41、使Doxo-敏感細(xì)胞中p53的活化受到抑制。
   2.HDM2的敲降增加了Doxo-耐藥NB細(xì)胞中Noxa的誘導(dǎo)表達(dá)
   Doxo處理后,與未敲低HDM2的Doxo-耐藥NB細(xì)胞(IMR32和NB-19細(xì)胞)相比,HDM2敲低細(xì)胞中,p53下游基因Noxa的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯增加。表明HDM2的敲降使Doxo-耐藥NB細(xì)胞中Noxa的表達(dá)增加。
   3.HDM2的過(guò)表達(dá)抑制了Doxo-敏感NB細(xì)

42、胞Noxa的誘導(dǎo)表達(dá)
   Doxo處理后,Doxo-敏感細(xì)胞(SK-N-SH細(xì)胞)中,Noxa mRNA的表達(dá)增加,而過(guò)表達(dá)HDM2的Doxo-敏感細(xì)胞(SK1細(xì)胞)中,Noxa的mRNA表達(dá)沒(méi)有改變。表明HDM2的過(guò)表達(dá)能夠抑制Noxa的誘導(dǎo)表達(dá)。
   4.在Doxo-耐藥的NB細(xì)胞中,p53轉(zhuǎn)錄活性被HDM2所抑制
   Doxo處理后,與未敲低HDM2的p53野生型Doxo-耐藥NB細(xì)胞(IMR32和N

43、B-19細(xì)胞)相比,HDM2敲低細(xì)胞中,其p53下游基因Noxa的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯增加;而在p53突變的NB細(xì)胞SK-N-DZ中,HDM2敲低后,Noxa的蛋白表達(dá)沒(méi)有增加。表明,Doxo耐藥細(xì)胞中的p53轉(zhuǎn)錄活性被HDM2所抑制。
   5.HDM2的過(guò)表達(dá)抑制了Doxo-敏感NB細(xì)胞中p53與Noxa上游p53順式作用元件的結(jié)合
   Doxo處理后,Doxo-敏感NB細(xì)胞(SK-N-SH細(xì)胞)的p53

44、能夠與Noxa上游的p53順式作用元件結(jié)合;而HDM2過(guò)表達(dá)的Doxo-敏感細(xì)胞(SK1細(xì)胞)中,p53與其順式作用元件的結(jié)合受到了抑制。表明HDM2的過(guò)表達(dá)能夠抑制Doxo-敏感的NB細(xì)胞中p53與Noxa上游p53順式作用元件的結(jié)合。
   小結(jié):高表達(dá)的HDM2通過(guò)與p53結(jié)合,抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性,下調(diào)其下游的凋亡基因表達(dá),導(dǎo)致p53野生型NB細(xì)胞抗凋亡,產(chǎn)生耐藥性。
   結(jié)論:高表達(dá)的HDM2通過(guò)抑制p53的

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