缺血預處理大鼠局灶性腦梗死后TLR-4信號傳導通路的表達.pdf

1、背景：
　　 腦血管病已經成為全球前三位的致死性疾病和首位的致殘性疾病，65歲以上的人群中有超過70％的人曾經歷過一次卒中發(fā)作，隨著社會老齡化的加快，患病人數還會繼續(xù)增加，其中缺血性腦卒中占85％。缺血性腦卒中的病理生理機制很復雜，但現在的研究認為腦缺血損傷和炎癥是病情進展的原因。
　　 腦組織供血中斷數秒內就快速啟動缺血級聯反應，最終導致梗死核心區(qū)細胞膜破壞、神經元死亡，其周圍大片缺血但未死亡的區(qū)域叫半暗帶，如能快速恢

2、復血流，半暗帶可以挽救。重度的腦血流低灌注，導致興奮毒性和過氧化損害，依次引起微血管損傷、血腦屏障破壞，然后啟動缺血后炎癥反應，加重腦缺血損傷并導致永久性腦組織損害。
　　 TLRs是最重要的模式識別受體家族之一，TLRs有富含亮氨酸重復序列的胞外區(qū)，用來識別模式相關分子病原，同時具有胞內TIR結構域，用以啟動細胞內信號傳導。近來得研究證實尤其是TLR4在腦缺血后的炎癥應答和炎癥介質的產生中起關鍵作用。在TLR4基因缺陷的小鼠中

3、腦梗死后腦損傷和神經功能損傷程度較野生型小鼠明顯減輕。TLR4激活后引起NF-κB核轉移，即TLR4/NF-κB信號可誘導TNF-α、IL6等炎性因子表達，產生炎癥反應;此外，有研究證實脂多糖可誘導BIT，通過負反饋環(huán)路抑制TLR4/NF-κB信號系統，使TLR4-TIRF信號周增強表達了抗炎癥因子IFN-β，使得炎癥反應減輕，產生BIT。因此，利用IPC制作pMCAO模型，探討IPC對腦梗死后TLR4信號軸相關炎性因子的表達特點，對進

4、一步明確BIT的內在保護機制，為腦梗死的治療提供新的策略有著重要的意義。
　　 方法：
　　 1.實驗采用SD大鼠，分為實驗組（IPC+pMCAO），對照組(SS+pMCAO)，假手術組(SS+SS)。
　　 2.IPC10min作缺血預處理，48h后制作腦梗死模型pMCAO。
　　 3.Longa5分法評價pMCAO后神經功能評分和24h后腦組織損傷程度。
　　 4.干濕重法腦含水量和腦梗塞面積

5、。
　　 5.RT-PCR技術測定pMCAO后6h，12h，24h，48h，72h共5個時間點TLR4mRNA, NF-κB p65mRNA。
　　 6.免疫組化技術測定pMCAO后6h，12h，24h，48h，72h共5個時間點TLR4，NF-κB，TRIF。
　　 7.ELISA技術測定pMCAO后6h，12h，24h，48h，72h共5個時間點TNF-α的表達。
　　 結果：
　　 1.結果

6、表明，實驗組神經功能評分明顯輕于對照組(P＜0.01)
　　 2.實驗組腦組織學缺血損害程度明顯較對照組減輕，炎癥細胞浸潤減少3.腦含水量、腦梗死面積均小于對照組(P＜0.01)
　　 4.RT-PCR測定結果發(fā)現實驗組和對照組TLR4mRNA，NF-κB p65mRNA均于6h可見表達，24h達高峰，此后表達逐漸下降，實驗組較對照組表達明顯減少。
　　 5.免疫組化則見對照組個時間點TLR4、NF-κB、TRI

7、F表達高于實驗組。
　　 6.ELISA分析示實驗組個時間點TNF-α含量明顯低于對照組。以上組間比較均有統計學差異(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 1.本研究證實IPC能明顯減輕腦梗死后的腦組織炎性反應，縮小腦梗死面積，誘導了BIT的產生。
　　 2.IPC抑制pMCAO后TLR4/NF-κB信號的轉導，減少了炎性細胞因子的產生。
　　 3.此外還通過負反饋機制上調了TRIF活性，增加了抗

8、炎性因子IFN-β的生成，減輕了嚴重缺血后腦炎性組織損害的程度。
　　 4.IPC通過抑制TLR4/NF-κB炎性信號通路、激活TRIF通路使得促炎性因子生成減少、抗炎性因子生成增加是產生BIT的重要機制。
　　 5.研究證明TLR4炎癥信號通路激活對腦缺血損傷起關鍵作用，并參與了BIT的誘導過程
　　 6.TLR4信號通路的干預將為急性腦卒中的治療提供新的策略。
　　 已有文獻大量研究表明IPC能誘導B

9、IT產生，但對pMCAO后TLR4信號軸炎性因子表達的影響研究不多。雖然BIT的確切分子機制并不明確，但是已初步證實需要新的蛋白質合成、促炎癥轉錄因子NF-κB的激活、誘導TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性細胞因子的產生。小劑量的LPS預處理能夠阻止MCAO后腦組織和周圍血的細胞炎性反應，抑制中性粒細胞在缺血腦組織浸潤和小膠質細胞/巨噬細胞的激活，減少腦缺血后TNF-α等的神經毒性作用，因此LPS預處理是腦梗死治療的潛在的有效方法。

10、TLR4在腦缺血后炎性損傷的重要作用有助于明確LPS預處理的神經保護機制。TLR4/NF-κB信號軸通過負反饋調節(jié)環(huán)路使得LPS預處理后的信號傳導減弱，該環(huán)路主要是阻止TLR4-MyD88間的作用，于是TLR4向NF-κB的信號傳導受到抑制，減少了炎性細胞因子的生成;同時再次暴露于LPS損傷時發(fā)現TLR4-IRF3軸的信號傳導增加，促進抗炎性因子IFN-β的釋放。
　　 與之相似，CpG預處理可通過TLR9信號軸引起同樣的抗炎癥

11、反應，誘導腦缺血耐受，并且二者存在交叉耐受，推測LPS和CpG預處理存在共同的作用機制。因此在缺血性卒中前給與TLR預刺激可能重新編程缺血誘導的TLR激活，可以認為LPS和CpG預處理可分別引起TLR4和TLR9的激活，引起輕微的炎癥反應，生成少量TNF-α，此時細胞通過表達TLR/NF-κB信號軸負反饋抑制因子來調節(jié)炎癥應答，只識別輕微腦缺血后產生的內源性TLR配體，在這種新的細胞環(huán)境下，再次刺激激活的TLR如TLR4或者TLR9則被

12、阻止，不能激活NF-κB誘導的信號通路，減輕了腦缺血損傷;同時缺血誘導的TLR4或TLR9信號從NF-κB誘導轉移到IRF3誘導，生成下游產物抗炎性因子IFN-β。
　　 因此，針對TLRs及其相關信號傳導通路的干預即在腦缺血前激活TLRs有可能成為腦梗死治療的潛在策略。除了LPS和CpG，TLRs的外源性配體HMGB1，同樣證明在小鼠腦缺血性卒中模型中，在腹腔注射HMGB1抗體能明顯減輕腦的缺血性損傷。
　　 腦缺血性

13、損傷的病理生理機制非常復雜，臨床治療手段也非常有限，目前也只有一種藥物即用于溶栓治療的重組纖溶酶原激活劑(r-tPA)被證實有效，但是應用時間窗很短（3小時），存在腦出血(6％)和再灌注損傷等并發(fā)癥，而絕大多數的急性缺血性卒中(AIS)患者不能再3小時內趕到醫(yī)院，從而不能應用r-tPA溶栓治療。因此，AIS的臨床藥物治療仍是一個很大的問題。BIT是近年來研究的熱點，并且從臨床現象也觀察到了人腦中BIT的存在。腦缺血后的炎癥反應是造成腦損

14、傷的重要原因，作為中樞神經系統先天免疫系統的關鍵組成部分，TLRs在介導腦缺血后炎癥損傷過程中起到了關鍵作用。本研究發(fā)現，IPC誘導的腦缺血耐受改變了TLR4信號軸相關炎性因子的表達模式，參與了BIT的產生，明顯減輕了pMCAO后的炎癥反應，減輕了腦缺血損傷的程度，因此，采用相應的制劑提前干預TLRs信號系統的某些作用環(huán)節(jié)，誘導TLRs信號軸重新編程，減輕腦缺血后的炎癥損傷，是治療急性腦梗死、改善預后的信策略，有望對急性腦梗死的治療帶來