Tac3-Tacr3在黑線倉鼠繁殖過程中的調(diào)控作用.pdf

1、動物的繁殖活動是由眾多因子通過錯綜復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸活動的一個極其復(fù)雜的過程。動物為了獲得最大的繁殖成功率，只在特定的季節(jié)進行繁殖活動，這種現(xiàn)象稱為季節(jié)性繁殖。季節(jié)繁殖是影響動物種群數(shù)量波動的主要原因之一，Tac3/Tacr3在調(diào)節(jié)動物季節(jié)性繁殖活動中發(fā)揮著重要作用。Tac3編碼神經(jīng)激肽B(NKB），NKB是一種含有特定的十個氨基酸的多肽；Tacr3編碼NK3R，NK3R是NKB的天然受體，屬于視紫紅質(zhì)七次跨膜

2、G蛋白偶聯(lián)受體家族。黑線倉鼠（Cricetulus barabensis）是典型的季節(jié)性繁殖動物，具有春、秋兩個繁殖高峰期，是研究動物季節(jié)性繁殖機制的理想模型。本研究以黑線倉鼠為材料，采用分子生物學方法和技術(shù)，檢測Tac3/Tacr3在黑線倉鼠的不同組織、不同發(fā)育階段及不同季節(jié)的差異表達，揭示Tac3/Tacr3系統(tǒng)參與動物季節(jié)性繁殖活動的調(diào)控機理，旨在從分子水平上探究黑線倉鼠種群數(shù)量的季節(jié)性爆發(fā)機制。
　　首先，以黑線倉鼠下丘腦

3、為材料，采用普通PCR擴增的方法得到黑線倉鼠Tac3 cDNA序列396bp（GenBank登錄號：KU519331），包括完整的編碼區(qū)序列360bp；獲得Tacr3 cDNA序列1256bp（GenBank登錄號：KU519332），包括編碼區(qū)序列1244bp。對其進行生物信息學分析，建構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　Tac3編碼119個氨基酸殘基，前21個為信號肽區(qū)域，C末端含有一個高度保守的結(jié)構(gòu)功能域，即特征性十肽-Asp-Met-Hi

4、s-Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-Met，是速激肽家族的典型特征。速激肽保守的羧基末端，是速激肽作用于受體的基本結(jié)構(gòu)，這種進化過程中的高度保守性說明這一類肽在生命活動中有著不可替代的重要作用。Tacr3編碼區(qū)長1244bp，編碼414個氨基酸殘基，對二級結(jié)構(gòu)進行分析表明整體疏水性較強。SMART對所得氨基酸序列進行相關(guān)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該序列存在7個明顯的高疏水區(qū)域，而這七個高疏水區(qū)組成七個完整的α螺旋結(jié)構(gòu)域，屬于典型的G

5、蛋白偶聯(lián)受體家族視紫紅質(zhì)亞家族。使用MEGA5.0軟件對黑線倉鼠的Tac3/Tacr3核苷酸序列與中國倉鼠、金黃倉鼠、牛、人等多個物種的相應(yīng)核苷酸序列進行比對，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，所得結(jié)果與傳統(tǒng)物種分類結(jié)果相一致。
　　其次，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Tac3和Tacr3在黑線倉鼠不同組織器官、不同發(fā)育階段、不同季節(jié)中的相對表達量，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測了不同發(fā)育階段、不同季節(jié)黑線倉鼠血清中NKB/NK3R（Tac3/Tacr3表

6、達蛋白）的濃度，探究該系統(tǒng)對繁殖活動的調(diào)控模式。
　　通過檢測Tac3和Tacr3在組織器官間的差異表達，發(fā)現(xiàn)Tac3和Tacr3在黑線倉鼠下丘腦中表達量遠遠高于在肝、腎、脾等其他器官組織中的表達量（P<0.01），而且血清中蛋白含量在不同發(fā)育階段差異并不顯著（P>0.05），表明Tac3/Tacr3系統(tǒng)主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)控作用，下丘腦是Tac3/Tacr3系統(tǒng)作用的關(guān)鍵部位。
　　通過檢測Tac3和Tacr3在不同

7、發(fā)育階段的差異表達，發(fā)現(xiàn)Tac3和Tacr3在雌性黑線倉鼠幼體時期表達量最高（P<0.05），在雄性黑線倉鼠亞成體時期表達量最高（P<0.05），推測該系統(tǒng)參與調(diào)控黑線倉鼠生殖活動的啟動，而且時間上存在著雌雄異型，主要體現(xiàn)在發(fā)育時期變化上。
　　季節(jié)性差異表達檢測結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)黑線倉鼠下丘腦中，Tac3在春秋季節(jié)的表達量顯著高于夏冬季節(jié)（P<0.05），與GnRH的季節(jié)表達模式相一致，也與黑線倉鼠季節(jié)性繁殖規(guī)律相一致，推測Tac3

8、的表達能促進GnRH的分泌，對黑線倉鼠的繁殖調(diào)控起到促進作用。雌性黑線倉鼠下丘腦中，受體基因Tacr3在夏秋季的表達量高于春冬季節(jié)（P<0.05），而雄性個體在春秋季節(jié)的表達量高于夏冬季節(jié)（P<0.05），這與GPR54（KiSS1受體)基因的表達結(jié)果大致相同，推測黑線倉鼠中Tac3/Tacr3系統(tǒng)與KiSS1/GPR54系統(tǒng)有著密不可分的聯(lián)系。Tacr3在雌性黑線倉鼠的下丘腦中夏季表達水平最高（P<0.05），推斷此現(xiàn)象可能與光照時長