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文檔簡介
1、本文旨在探討肝衰竭組織中HPC的增殖特點及其與STAT3及SOCS3表達的關系。并進一步以大鼠肝干細胞樣上皮細胞系WB-F344(簡稱WB細胞)為研究對象,探討STAT3及SOCS3在WB-F344細胞增殖及分化過程中的作用。 研究方法: (1)采用肝衰竭組織及急、慢性輕型肝炎組織標本共76例,病例選自1965年-2005年中國醫(yī)科大學第一臨床學院尸檢病例、肝臟外科手術病例及肝活檢病例。所有病例肝組織標本均經(jīng)甲醛固定,石
2、蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片進行HE染色以觀察病變特點;應用免疫組織化學方法(S-P法)進行OV6、CK19、p-STAT3及SOCS3的檢測。 結果判定:①OV6免疫組化染色半定量:OV6陽性表達于細胞漿。每張切片隨機選取5個高倍視野,每個視野計數(shù)100個細胞,計算陽性細胞的百分數(shù)?!?”:無HPC或有少量HPC;“+”:灶性HPC;“++”:連續(xù)性HPC,但范圍<50%匯管區(qū)和纖維間隔;“+++”:連續(xù)性HPC,但范圍>50%匯
3、管區(qū)和纖維間隔。以“-”為陰性,“+”“++”及“+++”為陽性。②CK19、p-STAT3及SOCS3免疫組化染色結果判定:每張切片隨機選取5個高倍視野,每個視野計數(shù)100個細胞,計算陽性細胞的百分數(shù)。CK19及SOCS3表達于細胞漿中,p-STAT3表達于細胞核,呈現(xiàn)棕色染色顆粒。無著色或陽性表達率≤25%為陰性,>25%為陽性。 (2)以大鼠肝干細胞樣上皮細胞系WB-F344細胞為研究對象,肝細胞生長因子fHepatic
4、growth factor,HGF)及JAK/STAT3通路抑制劑AG490作用于WB-F344細胞后,應用免疫熒光及Westem blot方法檢測HGF及AG490作用后細胞STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表達;應用RT-PCR方法檢測HGF及AG490作用后細胞SOCS3 mRNA的表達;應用流式細胞術及MTT法檢測HGF及AG490作用后細胞的細胞周期及凋亡的變化。 (3)應用HGF、表皮生長因子(Epithe
5、lial growth factor,EGF)、胰島素及地塞米松組成誘導分化體系(高糖DMEM,10%胎牛血清,HGF 10-50ng/ml,EGF 20ng/ml,胰島素1μg/ml及地塞米松1μmol/l),體外誘導WB-F344細胞向肝細胞定向分化。觀察分化過程中不同時點WB-F344細胞形態(tài)的變化。應用RT-PCR方法鑒定WB-F344細胞定向分化過程中分化標志白蛋白(Albumin,ALB)、甲胎蛋白(Alpha-1-feto
6、protein,AFP)及細胞角蛋白19(Cytokeratin,CK19)的表達。應用Western blot方法檢測WB-F344細胞定向分化過程中STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表達;應用RT-PCR方法檢測細胞分化過程中SOCS3 mRNA的表達。 (4)統(tǒng)計方法:所有資料采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 研究結果: (1)CK19免疫組化染色結果表明:亞
7、急性肝衰竭((subacute liver failure,SALF)、及慢加急性(亞急性)肝衰竭((acute-on-chronic liver failure,ACLF)組織中可見大量增生的膽管,包括典型增生膽管和非典型增生膽管。肝衰竭組織的CK19陽性率(62.5%)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(30%)(P<0.05);OV6作為肝前體細胞的標記抗體,其染色陽性的細胞主要有兩種形式。大部分是組成非典型增生膽管的管狀細胞;
8、另一種是匯管區(qū)出現(xiàn)的小肝細胞樣細胞。肝衰竭組織的OV6陽性率(85.7%)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(35.0%)(P<0.05);p-STAT3的陽性表達主要位于匯管區(qū)增生的膽管細胞、HPC、炎性細胞、竇內(nèi)皮細胞及肝細胞的細胞核中。肝衰竭組織的p-STAT3陽性率(67.9%)明顯高于急、慢性輕型肝炎的組織的陽性率(25%)(P<0.05);SOCS3的陽性表達主要位于匯管區(qū)的增生的膽管細胞、炎性細胞及肝細胞的細胞漿中。肝衰
9、竭組織的SOCS3陽性率(60.7%)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(35%)(P<0.05)_。相關分析表明,OV6的表達與CK19、p-STKT3及SOCS3的表達呈正相關(r<,s>分別為0.689,0.239及0.322,P<0.05)。 (2)STAT3水平在HGF作用于WB-F344細胞前后無明顯變化(P>0.05);HGF能夠促進STAT3的磷酸化,p-STAT3在HGF作用10分鐘后增加,完全磷酸化發(fā)生在H
10、GF作用30分鐘,60分鐘后表達逐漸減弱。應用AG490后p-STAT3表達減弱(P<0.05)_正常WB-F344細胞有SOCS3蛋白及mRNA表達,在HGF作用10分鐘后SOCS3表達增加,以后逐漸減弱。應用AG490后SOCS3表達減弱(P<0.05)。HGF作用于WB-F3#4細胞后細胞周期S期細胞數(shù)增加,G1期細胞數(shù)減少,凋亡細胞減少,這種作用呈劑量效應關系(P<0.05)。應甩AG490后能夠抑制WB-F344細胞的增殖,促
11、進細胞凋亡。 (3)WB-F344細胞在加入分化培養(yǎng)體系2天后細胞出現(xiàn)離散效應。實驗7天后細胞延伸并形成小梁樣結構,細胞逐漸由六邊形轉變?yōu)樗笮巍?1天后分化為肝細胞樣梭形形態(tài),細胞生長緩慢,形態(tài)逐漸出現(xiàn)分散。RT-PCR方法檢測表明細胞分化過程中表達肝細胞標志ALB的水平逐漸增加,作為肝干細胞標志之一的AFP的表達逐漸減少,CK19這一膽管細胞的表達標志逐漸減少(P<0.05)。上述結果提示HGF、EGF、胰島素及地塞米松可以誘
12、導WB-F344體外向肝細胞定向分化。應用Western blot方法檢測表明STAT3蛋白在分化過程中無明顯變化(P>0.05):p-STAT3蛋白表達在分化過程中逐漸減少(P<0.05);應用RT-PCR及Western blot方法檢測表明SOCS3 mRNA及蛋白表達在分化過程中逐漸減少(P<0.05)。 研究結論: (1)肝衰竭組織中存在HPC的增殖;肝衰竭組織中p-STAT3及SOCS3的表達增加,與HPC表
13、達成正相關。提示p-STAT3及SOCS3參與肝衰竭組織中HPC增殖的調(diào)控。 (2)HGF能夠促進WB-F344細胞STAT3的磷酸化水平,增加SOCS3表達;HGF能夠促進WB細胞的增殖并抑制細胞凋亡,STAT3及SOCS3參與了這一過程的調(diào)控。 (3)HGF、EGF、胰島素及地塞米松組成的分化培養(yǎng)體系能夠體外誘導WB-F344細胞向肝細胞定向分化;分化過程中p-STAT3及SOCS3的表達逐漸減少,提示其可能對于抑制
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