PI3K在ALS萎縮肌纖維中表達(dá)的意義.pdf

1、目的：肌萎縮側(cè)索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，主要累及脊髓前角、腦干后組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核以及錐體束，以上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元同時(shí)受損為特征。臨床常以單肢遠(yuǎn)端肌無(wú)力、萎縮為首發(fā)癥狀，逐漸累及其他肢體。上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累表現(xiàn)為腱反射活躍、病理反射陽(yáng)性：下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累表現(xiàn)為遠(yuǎn)端肌無(wú)力、萎縮。感覺(jué)和括約肌功能一般不受影響。近年來(lái)ALS確切發(fā)病機(jī)制未明確，目前研究認(rèn)為發(fā)病機(jī)制相關(guān)因素如下：遺

2、傳因子突變；興奮性氨基酸毒性增高；神經(jīng)絲（neurofilament，NF）異常聚集；線(xiàn)粒體功能障礙；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（neurotrophic factor，NTF）失調(diào)；蛋白質(zhì)聚集體等。眾多研究發(fā)現(xiàn)ALS發(fā)病與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡有關(guān)，本研究主要目的是探討ALS肌纖維萎縮與凋亡之間的關(guān)系。
　　 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病變導(dǎo)致骨骼肌失神經(jīng)支配，出現(xiàn)特征性病理變化-小角化肌纖維、肌纖維肥大、分裂肌纖維、 萎縮肌纖維成小群分部、核聚集、靶狀纖維、RR

3、F（Ragged Red Fiber）、肌纖維類(lèi)型群化或肌纖維優(yōu)勢(shì)。大量的國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)失神經(jīng)支配后骨骼肌肌纖維與細(xì)胞凋亡相關(guān)。ALS肌纖維中存在RRF，肌膜下線(xiàn)粒體聚集，顯著的COX、SDH、NADH-TR酶學(xué)改變，說(shuō)明ALS存在線(xiàn)粒體功能異常及氧化損傷現(xiàn)象，由此推測(cè)ALS線(xiàn)粒體功能障礙引起肌細(xì)胞凋亡可能是肌纖維萎縮的病理、生理學(xué)基礎(chǔ)。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是磷脂激酶

4、家族中的一個(gè)重要成員，PI3K活化產(chǎn)生的細(xì)胞膜類(lèi)脂產(chǎn)物3，4.二磷酸磷脂酰肌醇[PI（3，4）P2]和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI（3，4，5）P3]是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，它們能激活下游一系列蛋白激酶如Akt/PKB（protein kinase B，蛋白激酶B），PKC（protein kinase C，蛋白激酶C）和PKA（protein kinase A，蛋白激酶A），由此導(dǎo)致信號(hào)的進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和

5、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。
　　 本研究通過(guò)對(duì)ALS活檢骨骼肌組織化學(xué)及酶學(xué)染色病理分析；ALS肌纖維透射電鏡超微結(jié)構(gòu)變化分析；抗-P13K免疫組織化學(xué)染色肌纖維表達(dá)情況的分析，探討ALS肌纖維的凋亡機(jī)制。
　　 方法：選擇31例ALS患者作為研究對(duì)象，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)ALS的診斷標(biāo)準(zhǔn)——參照世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟（World Federation of Neurology，WFN）的診斷標(biāo)準(zhǔn)

6、。全部患者行開(kāi)放式肱二頭肌活檢，冰凍切片，組織化學(xué)及酶學(xué)染色（HE、GT、COX、NADH-TR、SDH、ATPase），抗-PI3K、NCAM單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及PI3K、NCAM在肌纖維的表達(dá)。部分患者活檢骨骼肌經(jīng)處理后（方法詳見(jiàn)研究論文）透射電鏡下分析肌纖維超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.ALS骨骼肌組織化學(xué)及酶學(xué)染色病理分析：
　　 ALS患者活檢骨骼肌病理

7、分析共同特點(diǎn)如下：明顯肌纖維大小不一，變性肌纖維散在，壞死、再生肌纖維少見(jiàn)；大量小角化肌纖維散在于肌束間，萎縮肌纖維群化，典型的核聚集現(xiàn)象，常見(jiàn)肌纖維肥大、分裂現(xiàn)象，結(jié)締組織不同程度增生；部分患者改良GT染色可見(jiàn)肌膜下嗜堿性顆粒聚集，偶見(jiàn)RRF；ATPase染色肌纖維類(lèi)型群化或優(yōu)勢(shì)；NADH-TR、SDH、COX酶染色胞漿中局灶性酶活性減低，可見(jiàn)典型靶狀纖維、蟲(chóng)噬纖維。
　　 2.ALS骨骼肌免疫組織化學(xué)染色病理分析：
　

8、　 抗-PI3K、NCAM（neural cell adhesion molecule，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子）單克隆抗體免疫組化染色，分析PI3K、NCZM在ALS肌纖維中表達(dá)，PI3K在萎縮肌纖維膜上呈陽(yáng)性表達(dá)，而NCAM在萎縮肌纖維中陰性表達(dá)。
　　 3.ALS骨骼肌電鏡下超微結(jié)構(gòu)病理改變分析：
　　 透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察：變性肌纖維中肌節(jié)結(jié)構(gòu)不清，粗細(xì)肌絲排列無(wú)序，局部肌絲呈灶狀溶解，Z線(xiàn)呈輕度水紋狀或排列不齊，肌原

9、纖維間充填大量糖原顆粒和變性線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體腫脹、膜嵴融合，可見(jiàn)空泡化線(xiàn)粒體。
　　 結(jié)論：
　　 1.ALS活檢骨骼肌病理分析：肌纖維膜下線(xiàn)粒體聚集、RRF，氧化酶（COX、SDH、NADH-TR）活性異常，而這些酶在細(xì)胞氧化過(guò)程中均為線(xiàn)粒體呼吸酶系的關(guān)鍵酶，提示ALS肌纖維中的線(xiàn)粒體氧化代謝障礙。
　　 2.PI3K是PI3K/Akt凋亡途徑重要信號(hào)，而PI3K在ALS萎縮肌纖維膜上顯著表達(dá)，NCAM在萎縮肌纖