靶向PI3K抗腫瘤藥物耐受機制研究.pdf

1、背景:
　　隨著分子靶向藥物在臨床中的應(yīng)用,腫瘤對藥物的耐受成為制約其療效的重要因素,而對于臨床試驗的藥物,藥物耐受更是導(dǎo)致其失敗的重要原因之一。腫瘤耐藥機制研究成為腫瘤生物學(xué)和治療學(xué)的重要領(lǐng)域。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族成員參與多種細胞信號通路,調(diào)控著眾多腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要的生物學(xué)過程,包括細胞生長、存活、增殖、血管生成、遷移和轉(zhuǎn)移等,且PI3K通常以異常活化的形式存在于人類許多腫瘤中,因而PI3K是個具有巨大潛力的

2、藥物治療靶點。其中PI3Kα亞型的擴增和突變是導(dǎo)致該信號通路過度活化的重要原因,多個靶向性候選藥物正處于積極的臨床研究中。PI3K處于龐大的細胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中,與多個信號通路存在交互通話,持續(xù)給藥后很可能產(chǎn)生獲得性耐藥,所以前瞻性的研究靶向PI3Kα抗腫瘤藥物耐受機制具有重要的意義,不僅能夠為可能出現(xiàn)的臨床耐受提供應(yīng)對措施,還能指導(dǎo)PI3Kα抑制劑的合理使用。
　　目的:
　　本課題旨在構(gòu)建對PI3Kα亞型選擇性抑制劑耐受的

3、人乳腺癌細胞SKBR3,探索靶向PI3Kα抗腫瘤藥物產(chǎn)生獲得性耐藥的潛在分子機制。尋找基于耐藥機制的用藥策略,為指導(dǎo)PI3Kα抑制劑合理應(yīng)用提供理論與實驗依據(jù)。
　　方法:
　　以本實驗室發(fā)現(xiàn)的PI3Kα亞型選擇性抑制劑CYH33為工具化合物,在體外采用低濃度逐步加量誘導(dǎo)法作用于人乳腺癌細胞SKBR3,建立CYH33耐藥細胞株SKBR3/CYH33。SRB法檢測耐藥細胞對各種抗腫瘤化合物的敏感性。計算耐藥指數(shù)。觀察并記錄親本

4、和耐藥細胞的形態(tài)學(xué)變化。采用細胞計數(shù)法進行細胞增殖曲線繪制和群體倍增時間測定。流式細胞術(shù)(FCM)檢測親本和耐藥細胞的大小和周期分布。高效液相色譜法檢測進入親本和耐藥細胞內(nèi)CYH33的濃度。采用mRNA微陣列分析篩選出 SKBR3及 SKBR3/CYH33細胞中差異表達的mRNA。選取與PI3K/mTOR信號通路關(guān)系密切且mRNA表達水平差異大的若干個基因,應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)進行驗證;Western blotting方法檢測親本

5、和耐藥細胞中PI3K下游主要效應(yīng)分子對CYH33的響應(yīng),考察信號通路的改變是否介導(dǎo)細胞耐藥。基于耐藥機制,采用聯(lián)合用藥方法提高耐藥細胞對 CYH33的敏感性。實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示,采用Microsoft excel軟件進行統(tǒng)計分析,組間差異采用t檢驗,統(tǒng)計結(jié)果以P>0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01表示顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)4個月的誘導(dǎo),建立的SK

6、BR3/CYH33細胞可在含10μM CYH33培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長、增殖。與親本細胞相比,耐藥細胞對CYH33有高達45倍的耐受。SKBR3/CYH33細胞變圓、體積變大,S期細胞比例無明顯變化,G2/M期細胞比例明顯增加,G1/G0期細胞比例略減少,但增殖速率并沒有明顯變化。其對PI3Kα亞型選擇性抑制劑CYH33和A66耐受最明顯,對PI3K泛抑制劑GDC0941耐受減弱,而對PI3K/mTOR雙重抑制劑或mTOR抑制劑的敏感性與親本

7、一致。親本和耐藥細胞內(nèi)的CYH33濃度無明顯差異。兩株細胞內(nèi)眾多基因的mRNA水平具有顯著差異。耐藥細胞中趨化因子CCL2/MCP-1顯著增加。CYH33對耐藥細胞中mTOR下游分子p70S6K1、rpS6及4EBP1的磷酸化水平抑制明顯減弱。mTOR抑制劑Rapamycin或AZD8055都可顯著提高耐藥細胞對CYH33的敏感性。
　　結(jié)論:
　　SKBR3/CYH33細胞構(gòu)建成功,可用于耐藥機制的研究。CYH33長期作用