hu3D3-cSA介導的多藥物肺癌預靶向治療的初步研究.pdf

1、抗體介導的腫瘤靶向治療已經成為抗腫瘤研究和臨床應用的熱點之一，但是傳統(tǒng)的以抗腫瘤單抗為載體直接偶聯效應分子的靶向治療只能攜帶一種藥物，往往不能達到理想的治療效果，且免疫偶聯物分子量較大，藥物的組織穿透能力有限，從而限制了藥物的使用劑量和臨床應用。為克服上述不足，本研究旨在以人源化的抗人肺癌單域抗體(hu3D3)為靶向載體，通過引入鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，構建一種能同時將多種藥物攜帶至腫瘤部位的靶向通用載體，實現肺癌的預靶向多藥物聯合治療

2、。 PCR擴增核心鏈霉親和素基因，克隆至質粒hu3D3/pET-22b(+)，構建表達載體hu3D3/cSA/pET-22b(+)，并轉化至E．coliBL21(DE3)中，IPTG誘導表達。鎳親和層析柱純化目的蛋白，采用透析和凝膠過濾層析的方法對純化產物進行復性。SDS-PAGE和Westernblot鑒定融合蛋白四聚體的形成。FITC標記hu3D3/cSA后，熒光顯微鏡分析融合蛋白中hu3D3組分的抗原反應性和特異性；流式細

3、胞術比較融合蛋白hu3D3/cSA和單域抗體hu3D3與靶抗原的結合能力。ELISA和Westernblot鑒定融合蛋白中cSA組分結合生物素的能力。臺盼藍染色計數法觀測各實驗組的A549細胞生長曲線，MTT法比較各藥物組對A549細胞的殺傷作用。結果表明，我們獲得了正確序列的hu3D3/cSA/pET22b(+)重組子，融合基因在E．coliBL21(DE3)中主要以包涵體的形式表達。純化復性后的融合蛋白能夠形成四聚體復合物，保留了c

4、SA結合生物素的活性，hu3D3組分能與肺癌細胞表面抗原結合，且結合能力比單域抗體hu3D3強6～9倍。生長曲線圖表明，hu3D3/cSA聯合生物素化藥物組比單純生物素化藥物組的細胞存活率低25％～30％；細胞殺傷實驗顯示，與單純的生物素化藥物組相比，hu3D3/cSA介導的生物素化藥物組對靶細胞A549的殺傷率提高了25％～35％。 總之，我們通過基因工程技術成功表達了融合蛋白hu3D3/cSA，融合蛋白具有結合靶抗原和生物素