VSAD1參與調(diào)控植物黃萎病的抗性反應(yīng).pdf

1、棉花黃萎病是一種由土傳真菌引起的維管束病害，在世界各產(chǎn)棉區(qū)均有分布，其病原菌主要為大麗輪枝菌和黑白輪枝菌。病菌侵染棉株后，會(huì)使葉片黃化，干枯，進(jìn)而導(dǎo)致棉株死亡。該病害致病機(jī)制復(fù)雜，具體抗性機(jī)制尚未明確，加之缺乏有效防治藥物和抗病材料，使得棉花黃萎病防治愈加困難。從分子水平尋找抗性基因是研究棉花黃萎病的一個(gè)可行途徑。由于棉花基因組較大等原因，此方面工作進(jìn)展緩慢。擬南芥作為模式植物，是黃萎病菌宿主之一，基因組背景已知，也可作為植物黃萎病抗性

2、機(jī)制的研究材料。
　　本研究依托實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的擬南芥與黃萎病菌的共同生長(zhǎng)體系，篩選EMS誘變的擬南芥突變體庫(kù)，鑒定了一批對(duì)黃萎病菌敏感的擬南芥突變體。vsad1-1突變體是篩選到的一個(gè)突變體，該突變體在受到病菌侵染后，葉片快速黃化、萎縮，花青素積累量極低，葉綠素和生物量下降。前期通過(guò)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證明該突變體為單基因隱性突變。利用圖位克隆技術(shù)，確定該突變基因位于擬南芥五號(hào)染色體上游，測(cè)序結(jié)果表明vsad1-1為基因At5g13930突變

3、產(chǎn)生的突變體，基因突變導(dǎo)致其編碼蛋白的第184位氨基酸由谷氨酸（E）變?yōu)橘嚢彼幔↘）。同期，我們還篩選到的另外一株黃萎病菌敏感型突變體vsad1-2，圖位克隆結(jié)果表明，vsad1-1和vsad1-2為等位突變體，vsad1-2是該基因點(diǎn)突變產(chǎn)生，其第49位蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼帷?br>　　為了驗(yàn)證突變位點(diǎn)的正確性，我們先是使用了SALK的VSAD1基因點(diǎn)突變體tt4-2進(jìn)行表型驗(yàn)證。在MS培養(yǎng)基上，突變體tt4-2和vsad1-1在黃萎病

4、菌感染時(shí)植株表現(xiàn)出相似的發(fā)病特征：相比野生型而言，子葉過(guò)早黃化，花青素積累量極低，葉綠素含量下降，并且提前抽薹；土中侵染實(shí)驗(yàn)表明，tt4-2和vsad1-1突變體死亡率比野生型WT升高15％左右。再者，我們用構(gòu)建的VSAD1基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化vsad1-1突變體，得到的超表達(dá)株系，植株花青素積累得到不同程度的恢復(fù)。以上結(jié)果說(shuō)明，vsad1-1是由At5g13930基因發(fā)生突變導(dǎo)致。
　　為了分析VSAD1基因受黃萎病菌誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)

5、特征，實(shí)驗(yàn)提取受黃萎病菌侵染的植株葉片RNA，通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，植株受病菌侵染時(shí)，VSAD1基因表達(dá)量明顯上調(diào)；同時(shí)，VSAD1:GUS轉(zhuǎn)基因植株染色表明：正常狀態(tài)下，植株各部分均有輕微染色，當(dāng)植株受到黃萎病菌侵染時(shí)，在葉片、下胚軸以及根部的染色明顯加深。植株GUS酶活性測(cè)定也表明，受黃萎病菌侵染后，植株的GUS酶活性上升43.6%。
　　為了分析vsad1突變體對(duì)黃萎病菌的敏感性是否與其植株體內(nèi)菌含量有關(guān)，論文參照已有文

6、獻(xiàn)中所報(bào)道的黃萎病菌β-微管蛋白序列，設(shè)計(jì)特異性引物VerACT，通過(guò)定量PCR技術(shù)檢測(cè)植株體內(nèi)黃萎病菌的含量。QRT-PCR結(jié)果表明vsad1-1體內(nèi)大麗輪枝菌含量是WT的2.86倍。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道稱VSAD1參與植物花青素的合成，論文設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)證明葡萄籽花青素提取物對(duì)黃萎病菌有一定的抑制作用，隨著濃度升高，病菌生長(zhǎng)減速。并且，我們從擬南芥葉片中提取花青素進(jìn)行同樣的抑制試驗(yàn)，結(jié)果同葡萄籽花青素效果基本一致，擬南芥葉片花青素可以抑制大麗輪