腸炎沙門(mén)菌效應(yīng)蛋白AvrA參與宿主炎性反應(yīng)機(jī)制.pdf

1、沙門(mén)菌(Salmonella)是一種革蘭陰性、兼性厭氧的胞內(nèi)病原菌，可感染人和多種動(dòng)物，不僅能引起畜禽的發(fā)病和死亡造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并可通過(guò)被污染的畜禽制品引發(fā)人食源性疾病嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全。腸炎沙門(mén)菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis，Salmonella Enteritidis）屬于廣宿主譜的沙門(mén)菌血清型，在過(guò)去20年中盡管采取了一系列的防控措施，該菌已逐漸成為導(dǎo)致人沙門(mén)菌病的主要血

2、清型之一。沙門(mén)菌通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢ secretion system，T3SS)產(chǎn)生一系列的效應(yīng)蛋白。這些效應(yīng)蛋白具有多種生物學(xué)活性，影響宿主細(xì)胞的功能，以利于其感染宿主細(xì)胞和在胞內(nèi)的存活復(fù)制，其中包括對(duì)腸上皮細(xì)胞的緊密連接(Tight junctions，TJs)蛋白及其上游信號(hào)分子的調(diào)控。
　　人類因食用被沙門(mén)菌污染的畜禽制品而感染沙門(mén)菌，在條件較差地區(qū)也可能因糞便污染而感染。沙門(mén)菌引起的人沙門(mén)菌病主要癥狀包括腹痛、

3、痙攣、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)燒和頭痛等。近年來(lái)相關(guān)報(bào)道顯示，腸炎沙門(mén)菌也與腸道外的感染病例相關(guān)，如敗血癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、感染性心內(nèi)膜炎、尿路感染等。沙門(mén)菌感染宿主后，炎性反應(yīng)的發(fā)生依賴于多種效應(yīng)蛋白分子的參與，且不同的效應(yīng)分子表現(xiàn)出促炎效應(yīng)或抑炎效應(yīng)的特征。因此，開(kāi)展對(duì)腸炎沙門(mén)菌炎性相關(guān)效應(yīng)蛋白的研究以揭示該菌在感染宿主過(guò)程中的炎性反應(yīng)規(guī)律顯得尤為重要。AvrA在鼠傷寒沙門(mén)菌中為致病島Ⅰ(Salmonella pathogen

4、icityisland1，SPI-1) T3SS效應(yīng)蛋白之一，具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性，可抑制JNK/AP-1和NF-κB信號(hào)通路，AvrA還具有去泛素化酶活性可抑制β-catenin和IκBα的降解，從而抑制NF-κB信號(hào)通路和活化β-catenin通路。前期對(duì)AvrA效應(yīng)蛋白功能的研究主要以鼠傷寒沙門(mén)菌為對(duì)象，而關(guān)于腸炎沙門(mén)菌的研究涉及很少，效應(yīng)蛋白AvrA在腸炎沙門(mén)菌感染過(guò)程中發(fā)揮的具體作用也未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究首先構(gòu)建了腸炎

5、沙門(mén)菌C50336效應(yīng)蛋白AvrA的基因缺失株與質(zhì)?；貜?fù)株，其后在體內(nèi)外感染模型中對(duì)腸炎沙門(mén)菌C50336野生株及C50336△avrA缺失株對(duì)宿主細(xì)胞基本炎性反應(yīng)規(guī)律的影響進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步揭示了該菌中效應(yīng)蛋白AvrA參與宿主炎性反應(yīng)的機(jī)制。
　　1.腸炎沙門(mén)菌C50336△avrA缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
　　利用λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建了腸炎沙門(mén)菌C50336株的avrA基因缺失株，并以pBR322-avrA質(zhì)粒

6、介導(dǎo)的回補(bǔ)法構(gòu)建了相應(yīng)的回復(fù)株。開(kāi)展了對(duì)缺失株生物學(xué)特性的研究，包括測(cè)定缺失株及回復(fù)株的生長(zhǎng)、生化特性及其對(duì)小鼠的致病能力和體外對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附侵襲及胞內(nèi)增殖能力。結(jié)果顯示，腸炎沙門(mén)菌avrA基因缺失后:(1)在LB中的生長(zhǎng)速度、生理生化特性與野生株、回復(fù)株相同;(2)在體外培養(yǎng)條件下無(wú)avrA的mRNA轉(zhuǎn)錄，且無(wú)AvrA蛋白表達(dá)。在avrA回復(fù)株中，avrA mRNA轉(zhuǎn)錄水平約為野生株的2倍，體外培養(yǎng)條件下AvrA蛋白表達(dá)量高于野生

7、株;(3)在體外培養(yǎng)條件下avrA的缺失不影響其它炎性相關(guān)效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄;(4) C50336△avrA缺失株對(duì)小鼠的LD50為6.9×103，野生株與回復(fù)株分別為5.0×105和2.0×105。相較于野生株，C50336△avrA缺失株對(duì)小鼠的毒力增強(qiáng)約70倍;(5) C50336△avrA缺失株對(duì)腸上皮細(xì)胞Caco-2 BBE的侵襲能力顯著增強(qiáng);(6) C50336△avrA缺失株在腸上皮細(xì)胞Caco-2 BBE中的胞內(nèi)增殖能力降低

8、。此外，本部分內(nèi)容還表達(dá)和純化了AvrA蛋白并制備了AvrA蛋白的多克隆抗體，Western blot結(jié)果顯示該多抗具有較高的特異性。構(gòu)建的pCMV-HA-AvrA及AvrA點(diǎn)突變的pCMV-HA-AvrA(C186A)真核表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)Caco-2 BBE有較高的轉(zhuǎn)染及表達(dá)效率。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究效應(yīng)蛋白AvrA對(duì)腸炎沙門(mén)菌與宿主炎性反應(yīng)關(guān)系提供了基本生物學(xué)材料。
　　2.腸炎沙門(mén)菌C50336△avrA缺失株體內(nèi)外感染過(guò)程中宿

9、主的炎性反應(yīng)規(guī)律
　　利用沙門(mén)菌體外感染人腸上皮細(xì)胞Caco-2 BBE模型和鏈霉素預(yù)處理的小鼠體內(nèi)感染模型，對(duì)腸炎沙門(mén)菌C50336、C50336△avrA缺失株及回復(fù)株在感染過(guò)程中宿主炎性反應(yīng)的基本規(guī)律進(jìn)行了研究。包括對(duì)體外感染過(guò)程中Caco-2 BBE細(xì)胞炎性因子轉(zhuǎn)錄水平及培養(yǎng)上清中炎性因子含量的測(cè)定，以及感染后對(duì)小鼠存活率的測(cè)定、體重變化及各臟器帶菌情況，并分別于感染后8小時(shí)的早期感染點(diǎn)和感染后4天的晚期感染點(diǎn)對(duì)小鼠各臟器

10、中炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平及血清中炎性因子的濃度進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，腸炎沙門(mén)菌感染Caco-2BBE后，IL-1β、COX-2、IL-8、iNOS、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、P62的轉(zhuǎn)錄水平主要在細(xì)胞感染早期上調(diào)，且以IL-8上調(diào)水平最高。IL-17A、IL-4、IL-12β、IL-18、LC3A、LC3B等基因轉(zhuǎn)錄水平均有少量上調(diào)，但主要在細(xì)胞感染晚期。感染后6小時(shí)，C50336△avrA缺失株感染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL

11、-6、TNF-α、IL-8、GM-CSF、IP-10、IL-1Rα、IL-1β含量顯著高于野生株和回復(fù)株感染組，而IL-12、IFN-γ、MCP-1含量在沙門(mén)菌感染后升高，但在不同菌株感染組之間無(wú)顯著差異。說(shuō)明腸炎沙門(mén)菌感染可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生快速而強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)，且avrA基因缺失后，腸炎沙門(mén)菌誘導(dǎo)宿主炎性反應(yīng)的能力顯著升高。
　　小鼠體內(nèi)感染結(jié)果顯示，C50336△avrA缺失株感染后小鼠體重減輕程度及死亡率均高于野生株與回復(fù)株

12、感染組，進(jìn)一步表明avrA基因缺失導(dǎo)致腸炎沙門(mén)菌對(duì)小鼠的毒力上升。沙門(mén)菌感染后小鼠臟器帶菌結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)臟器帶菌量在感染后第3天達(dá)到最大值。對(duì)感染后8小時(shí)和4天臟器帶菌量比較結(jié)果顯示，感染后8小時(shí)小鼠肝臟和脾臟內(nèi)未檢測(cè)出沙門(mén)菌，而在腸道內(nèi)可檢測(cè)出大量沙門(mén)菌。感染后4天，小鼠回腸、盲腸和肝臟中沙門(mén)菌定殖量在不同菌株感染組間無(wú)統(tǒng)計(jì)差異，但C50336△avrA缺失株感染組小鼠脾臟及結(jié)腸帶菌量顯著高于野生株和回復(fù)株感染組。說(shuō)明avrA缺失

13、后腸炎沙門(mén)菌在小鼠體內(nèi)擴(kuò)散定殖能力增強(qiáng)。
　　小鼠不同臟器中炎性因子表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，沙門(mén)菌感染后8小時(shí)的小鼠回腸組織中IFN-γ、 IL-1β、IL-10和IL-6轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，且在C50336△avrA缺失株感染組小鼠中轉(zhuǎn)錄水平高于野生株與回復(fù)株感染組小鼠。沙門(mén)菌感染后8小時(shí)，小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-17A轉(zhuǎn)錄水平較未感染組顯著升高，但在三個(gè)不同菌株感染組間無(wú)顯著差異。感染后4天，iNOS、COX-2轉(zhuǎn)錄水平

14、高于未感染組及感染后8小時(shí)的水平，但在不同菌株間無(wú)顯著差異，而IFN-γ、 IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18和TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平較未感染組和感染后8小時(shí)的水平顯著升高，同時(shí)在C50336△avrA缺失株感染組小鼠中表達(dá)量顯著高于野生株與回復(fù)株感染組。腸炎沙門(mén)菌感染后可誘導(dǎo)小鼠腸道炎癥的發(fā)生，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，avrA缺失后腸炎沙門(mén)菌誘導(dǎo)小鼠腸道組織炎性反應(yīng)的能力增強(qiáng)。此外，沙門(mén)菌感染后小鼠結(jié)腸組織中炎性因子轉(zhuǎn)錄水平變化高

15、于小鼠回腸組織的變化，說(shuō)明小鼠結(jié)腸對(duì)于沙門(mén)菌的炎性反應(yīng)性更強(qiáng)。
　　沙門(mén)菌感染后4天的小鼠肝臟組織中炎性因子轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，因感染早期沙門(mén)菌主要定殖于小鼠消化道，感染后8小時(shí)在肝組織中未檢測(cè)到沙門(mén)菌。其中IFN-γ、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平于沙門(mén)菌感染后4天顯著升高，且在C50336△avrA缺失株感染組小鼠中表達(dá)量顯著高于野生株與回復(fù)株感染組。沙門(mén)菌感染后4天，小鼠脾臟組織中TNF-α、I

16、L-17A、IFN-γ、 IL-1β、IL-6、IL-18、iNOS和COX-2轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，在C50336△avrA缺失株感染組小鼠中表達(dá)量顯著高于野生株與回復(fù)株感染組。沙門(mén)菌感染后8小時(shí)，小鼠血清中炎性因子含量無(wú)明顯變化。但在感染后4天，血清中GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α、IP-10、KC、MCP-1和VEGF含量均顯著升高，且以上因子在C5

17、0336△avrA缺失株感染組小鼠血清中含量高于野生株與回復(fù)株感染組。MIG含量在感染后4天高于感染后8小時(shí)和未感染組，但在三個(gè)不同菌株間無(wú)差異。沙門(mén)菌感染后不僅誘導(dǎo)腸道局部炎性反應(yīng)，沙門(mén)菌通過(guò)腸道屏障后進(jìn)入其它臟器，也引起小鼠全身性的炎性因子表達(dá)，avrA缺失后，導(dǎo)致腸炎沙門(mén)菌在小鼠體內(nèi)的擴(kuò)散與定殖及誘導(dǎo)小鼠炎性因子產(chǎn)生的能力顯著升高。說(shuō)明腸炎沙門(mén)菌效應(yīng)蛋白AvrA為抑炎分子，它在腸炎沙門(mén)菌感染宿主過(guò)程中可抑制宿主細(xì)胞的過(guò)度炎性反應(yīng)。

18、AvrA缺失后，在小鼠各臟器組織中炎性因子IL-8(IL-6)、IFN-γ、 iNOS、IL-1β和IL-18顯著升高，提示AvrA可能還參與宿主細(xì)胞炎性小體形成與細(xì)胞焦亡的發(fā)生。上述結(jié)果進(jìn)一步完善和補(bǔ)充了沙門(mén)菌與宿主間相互作用關(guān)系及宿主炎性反應(yīng)規(guī)律的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，為進(jìn)一步揭示效應(yīng)蛋白AvrA抑炎機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　3.腸炎沙門(mén)菌AvrA阻斷JNK通路穩(wěn)定腸上皮緊密連接降低宿主炎性反應(yīng)
　　在已構(gòu)建的腸炎沙門(mén)菌C50336△

19、avrA缺失株、回復(fù)株及沙門(mén)菌在體內(nèi)外感染模型的基本炎性反應(yīng)規(guī)律的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)AvrA在體內(nèi)外感染過(guò)程中所引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的變化及其機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，腸炎沙門(mén)菌感染腸上皮細(xì)胞Caco-2 BBE后，細(xì)胞內(nèi)p-JNK、Cleaved-Caspase-3、P53、Beclin-1、Bax、LC3B、P62、ATG16L1、p-P38、p-P65、P65、p-mTOR表達(dá)量顯著升高，其中p-JNK、Cleaved-Caspas

20、e-3、P53、Beclin-1、Bax和LC3B的表達(dá)量在C50336△avrA缺失株感染組中顯著高于野生株與回復(fù)株感染組。細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)結(jié)果顯示，C50336△avrA缺失株感染組細(xì)胞凋亡比率顯著增高，且主要以AnnenxinⅤ陽(yáng)性PI陰性的早期凋亡細(xì)胞為主。Caco-2 BBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-HA-AvrA后，細(xì)胞中p-JNK表達(dá)量低于空質(zhì)粒及pCMV-HA-AvrA(C186A)轉(zhuǎn)染組，進(jìn)一步證實(shí)腸炎沙門(mén)菌AvrA可抑制JN

21、K磷酸化。腸炎沙門(mén)菌C50336△avrA缺失株感染Caco-2 BBE細(xì)胞后細(xì)胞中p-JNK表達(dá)量增高，且顯著高于野生株與回復(fù)株感染組。同時(shí)，緊密連接蛋白ZO-1在C50336△avrA缺失株感染組表達(dá)量低于野生株與回復(fù)株，而其它緊密連接蛋白，如Occludin、Claudin-1、Claudin-7和黏附連接蛋白E-Cadherin表達(dá)量無(wú)明顯變化。此結(jié)果在非極性腸上皮細(xì)胞HCT116和極性細(xì)胞SKCO15細(xì)胞系中均得到驗(yàn)證。對(duì)ZO

22、-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果顯示，腸炎沙門(mén)菌對(duì)ZO-1蛋白的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，而非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。對(duì)ZO-1的免疫熒光結(jié)果顯示，沙門(mén)菌感染后Caco-2 BBE細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1結(jié)構(gòu)遭到不同程度破壞，其中C50336△avrA缺失株感染細(xì)胞ZO-1無(wú)清晰完整的結(jié)構(gòu)，而黏附連接蛋白E-Cadherin未發(fā)生明顯變化。腸炎沙門(mén)菌感染后1-8小時(shí)，Caco-2 BBE單層細(xì)胞TEER值持續(xù)下降，其中，C50336△avrA缺失株

23、感染組TEER下降程度較野生株與回復(fù)株感染組更大，在感染后2-8小時(shí)有顯著性差異。ZO-1的免疫熒光結(jié)果和TEER結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)前一部分中avrA缺失導(dǎo)致腸炎沙門(mén)菌侵襲量升高的原因主要為腸上皮細(xì)胞間緊密連接被破壞。
　　腸炎沙門(mén)菌感染后8小時(shí)小鼠盲腸即有病理學(xué)變化出現(xiàn)，半定量評(píng)分結(jié)果顯示，C50336△avrA缺失株感染組小鼠盲腸出現(xiàn)中度炎癥病變，而野生株與回復(fù)株感染組小鼠盲腸僅出現(xiàn)輕微炎癥，病理學(xué)損傷較小。沙門(mén)菌感染后4天，av

24、rA感染組小鼠盲腸出現(xiàn)嚴(yán)重組織水腫，大量PMN浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞基本消失，組織結(jié)構(gòu)完全破壞，為重度腸道炎癥病變。野生株與回復(fù)株感染組小鼠盲腸也出現(xiàn)較嚴(yán)重的病理?yè)p傷現(xiàn)象，但相較于C50336△avrA缺失株組，炎癥損傷較輕。C50336△avrA缺失株感染組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中磷酸化的JNK表達(dá)量顯著高于野生株與回復(fù)株感染組，同時(shí)，ZO-1表達(dá)量降低，與Caco-2 BBE的體外試驗(yàn)結(jié)果相一致。小鼠腸組織切片的免疫熒光進(jìn)一步顯示，腸炎沙門(mén)菌感染

25、后，小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中緊密連接和黏附連接結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度破壞，其中Claudin-7及E-Cadherin在不同菌株感染組間無(wú)明顯差異，而ZO-1在C50336△avrA缺失株感染小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中無(wú)相對(duì)完整結(jié)構(gòu)，破壞程度高于野生株與回復(fù)株感染小鼠。
　　小鼠腸黏膜層組織的Western blot結(jié)果顯示，C50336△avrA缺失株感染后8小時(shí)小鼠腸上皮黏膜層腸上皮細(xì)胞Cleaved-Caspase-3表達(dá)量升高。免疫熒光結(jié)果進(jìn)

26、一步發(fā)現(xiàn)C50336△avrA缺失株感染后8小時(shí)，腸道細(xì)胞即可檢測(cè)到凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，而在野生株、回復(fù)株感染組與未感染組中未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡。腸炎沙門(mén)菌感染后4天，腸組織細(xì)胞均可觀察到凋亡細(xì)胞，而相較于野生株與回復(fù)株，C50336△avrA缺失株感染組中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多。
　　JNK抑制劑預(yù)處理的腸上皮細(xì)胞感染結(jié)果顯示，SP600125可抑制C50336△avrA缺失株感染Caco-2 BBE細(xì)胞后引起的p-JNK的上調(diào)和ZO-1

27、表達(dá)量的下降，且JNK抑制劑處理后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8含量也相應(yīng)的降低。說(shuō)明AvrA通過(guò)對(duì)JNK信號(hào)通路的抑制而穩(wěn)定腸上皮緊密連接，降低宿主細(xì)胞炎性反應(yīng)。進(jìn)一步對(duì)JNK下游通路的檢測(cè)結(jié)果顯示，腸炎沙門(mén)菌感染Caco-2 BBE和HCT116后，細(xì)胞中p-c-Jun和c-Jun表達(dá)量在沙門(mén)菌感染后顯著增高，且C50336△avrA缺失株感染組細(xì)胞中c-Jun的磷酸化水平顯著高于野生株與回復(fù)株感染組。而FoxO4及磷酸化的FoxO4表達(dá)

28、無(wú)明顯變化。JNK抑制劑可抑制p-c-Jun和c-Jun的表達(dá)，但對(duì)FoxO4及其磷酸化無(wú)顯著影響。雙熒光報(bào)告載體檢測(cè)AP-1轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)果顯示，C50336△avrA缺失株感染的Caco-2 BBE和HCT116細(xì)胞中AP-1熒光素酶活性均顯著高于野生株與回復(fù)株，同時(shí)SP600125抑制AP-1熒光素酶活性。
　　本部分內(nèi)容對(duì)腸炎沙門(mén)菌在體內(nèi)外感染過(guò)程中宿主炎性反應(yīng)及其機(jī)制作了進(jìn)一步研究，揭示腸炎沙門(mén)菌效應(yīng)蛋白AvrA抑制宿主細(xì)