p15因子與肝癌多藥耐藥的相關(guān)性及作用機(jī)制的研究.pdf

1、腫瘤的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要因素，也是影響患者生存的主要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有90％以上的腫瘤患者其化療失敗的原因不同程度地與MDR有關(guān)。而TGF-beta/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)腫瘤多藥耐藥起到非常重要的雙向調(diào)節(jié)作用：腫瘤發(fā)生早期，TGF-beta通過其廣泛的多細(xì)胞抑制達(dá)到腫瘤抑制因子的作用；腫瘤形成后期，則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的。 P15，即細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶

2、抑制因子2B，又稱Cdkn2b、INK4B，屬INK4蛋白家族，又稱多腫瘤抑制基因（MTS1）。P15系TGF-beta/smads信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)下游區(qū)的十分重要的細(xì)胞生長(zhǎng)周期的抑制因子，其表達(dá)受到TGF beta的誘導(dǎo)，在TGF beta信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要介導(dǎo)G1期阻滯的作用[3、6]。通過Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和myc所致的生長(zhǎng)阻滯的解除，TGF-β可以快速誘導(dǎo)P15在許多不同類型的細(xì)胞中的表達(dá)[7]。同時(shí)TGF-β抑制cdk2激酶活性，

3、提高p15蛋白的表達(dá)水平。 所以，本課題擬通過調(diào)節(jié)HepG2/CDDP耐藥細(xì)胞株中p15蛋白的表達(dá)，進(jìn)而探討p15與HepG2/CDDP耐藥細(xì)胞株多藥耐藥的相關(guān)性及其可能的調(diào)控作用機(jī)制。 目的:（1）檢測(cè)P15在HepG2/CDDP動(dòng)態(tài)的耐藥模型中的表達(dá)情況。（2）P15對(duì)HepG2耐藥細(xì)胞的表型的作用；（3）探討p15介導(dǎo)HepG2/CDDP細(xì)胞株多藥耐藥性變化的可能機(jī)制。 方法:（1）采用低濃度逐步遞增法，建

4、立HepG2/CDDP動(dòng)態(tài)的耐藥模型[9、10、11]；（2）將P15編碼區(qū)片段插入pcDNA3.1以及構(gòu)建P15正義表達(dá)載體，將HepG2耐藥細(xì)胞分成3組，分別用P15正義表達(dá)載體、pcDNA3.1空載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到其中2組，另一組為陰性對(duì)照組，Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染；（3）RT-PCR和Western blot檢測(cè)P15的表達(dá)；（4）流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2/CDDP耐藥細(xì)胞株內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留，并以此計(jì)算藥物的泵出

5、率；（5）流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，并計(jì)算細(xì)胞的增殖指數(shù)（PI）；（6）Western blot檢測(cè)細(xì)胞膜藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白MRP、P-gp蛋白的表達(dá)；（7）Western blot檢測(cè)及細(xì)胞凋亡分子BCL-2、Bax的表達(dá)。 結(jié)果: （1）成功用順鉑誘導(dǎo)HepG2耐藥，并建立HepG2/CDDP耐藥模型，耐藥指數(shù)為6.75μg/ml； （2）RT-PCR和Western blot檢測(cè)P15

6、在2.Oμg/ml的CDDP誘導(dǎo)培養(yǎng)HepG2/CDDP耐藥細(xì)胞24h、48h、3d、Sd、7d后，隨著HepG2/CDDP耐藥細(xì)胞株耐藥表型的增強(qiáng)，P15表達(dá)水平逐漸下降； （3）成功構(gòu)建p15正義表達(dá)載體；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后建立P15表達(dá)升高的細(xì)胞系 HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15，空載體對(duì)照細(xì)胞系HepG2/CDDP-pcDNA3.1及親本細(xì)胞HepG2/CDDP，RT-PCR和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染

7、成功，p15正義表達(dá)載體可上調(diào)P15的表達(dá)； （4）HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留增高； （5）HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15細(xì)胞增殖指數(shù)降低，細(xì)胞增殖能力減弱； （6）HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15細(xì)胞的MRP、P-gp蛋白的表達(dá)下降； （7）HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)上升。