小柴胡湯調控miR-122逆轉肝癌多藥耐藥的作用機制.pdf

1、目的:
　　通過體內外實驗研究小柴胡湯對肝癌多藥耐藥的逆轉作用，并探討其機制及作用靶點。
　　方法:
　　1.體外實驗:通過MTT法檢測肝癌親本細胞BEL-7402及耐藥細胞株BEL-7402/5-FU的細胞活力，應用SPSS軟件計算耐藥指數和小柴胡湯的逆轉倍數，驗證BEL-7402/5-FU耐藥細胞對化療藥物的耐藥性以及小柴胡湯對化療藥物的逆轉耐藥作用;MTT法檢測小柴胡湯對耐藥細胞的活力的影響，倒置相差顯微鏡觀察細

2、胞的形態(tài)學變化，集落形成實驗檢測小柴胡湯對耐藥細胞存活能力的影響，流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期分布研究小柴胡湯對BEL-7402/5-FU耐藥細胞增殖的影響;Hoechst33258染色觀察小柴胡湯對BEL-7402/5-FU耐藥細胞凋亡的影響;AnnexinⅤ-PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞早期凋亡研究小柴胡湯對BEL-7402/5-FU細胞凋亡的影響;采用熒光素酶報告基因檢測ATP含量;高效液相色譜儀(HPLC)檢測小柴胡湯對細胞內

3、5-FU蓄積的影響;流式細胞儀(FCM)檢測小柴胡湯對細胞內阿霉素(ADM)和羅丹明(Rho123)濃度的影響。通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western Blot法檢測小柴胡湯對Bax、Bcl-2、CyclinG1及ABCB1(p-gp)、ABCC1(MRP1)、ABCG2(BCRP)在mRNA和蛋白水平表達的影響。
　　2.體內實驗:分別將BEL-7402細胞及其耐藥株BEL-7402/5-FU細胞接種于裸鼠腋下

4、建立裸鼠的皮下移植瘤模型，用5-FU(20 mg/kg)連續(xù)干預21天，檢測兩種移植瘤裸鼠的體重、瘤體變化和瘤重等觀察耐藥細胞建立的皮下移植瘤組織的耐藥性;建立裸鼠的耐藥移植瘤模型，按照體重隨機分為對照組、5-FU組(20 mg/kg)、小柴胡湯組(XCHT，14.2 g/kg)和聯合給藥（5-FU+XCHT）組，分別給藥21天，檢測體重變化評估藥物的毒副作用，觀察和測量移植瘤裸鼠的腫瘤體積和重量評估小柴胡湯對裸鼠移植瘤生長的影響;通過

5、TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling(TUNEL)法檢測小柴胡湯對耐藥移植瘤組織細胞凋亡的影響，應用免疫組織化學法(IHC)研究小柴胡湯對耐藥移植瘤組織Ki-67表達的影響;通過RT-PCR和Western-Blot法檢測小柴胡湯對Bax、Bcl-2、CyclinG1及ABCB1(p-gp)、ABCC1(MRP1)、ABCG2(BCRP) mRNA和蛋白表達的影響。
　　3.靶點驗證:繪制BEL-

6、7402和BEL-7402/5-FU細胞的生長曲線，分別計算其倍增時間;qPCR檢測BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞及其移植瘤組織miR-122的表達;BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞分別轉染inhibitor-miR-122(ASO-miR-122)或mimics-miR-122，檢測miR-122表達及對化療藥物耐藥性;觀察BEL-7402/5-FU細胞轉染mimics-miR-122后的細胞形態(tài)及細

7、胞數改變，DAPI染色和AnnexinⅤ-PI凋亡檢測試劑盒檢測miR-122對細胞凋亡影響;克隆形成實驗和細胞周期檢測miR-122對細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測細胞內Rho123和ADM的蓄積情況，觀察miR-122對藥物外排功能的影響。采用qPCR和Western Blot法檢測miR-122對靶基因Bax、CDK4、CyclinG1和ABCB1表達的影響。
　　結果:
　　1、細胞實驗:(1)BEL-7402/5-

8、FU細胞經5-FU、ADM和DDP干預48 h后的IC50均顯著大于BEL-7402細胞，耐藥指數(RI)分別為6501.99，31.73和13.82;(2)0.5 mg/mL或1.0 mg/mL小柴胡湯分別與5-FU和ADM聯合干預BEL-7402和BEL-7402/5-FU，與單獨使用5-FU和ADM相比較，兩株細胞的IC50均顯著降低，0.5 mg/mL或1.0 mg/mL小柴胡湯對5-FU和ADM的逆轉倍數分別是1.66，3.4

9、4和1.50，5.58，相對逆轉率分別為39.88％，71.34％和34.11％，84.51％;(3)小柴胡湯抑制BEL-7402/5-FU細胞增殖:MTT檢測細胞活力發(fā)現小柴胡湯顯著降低BEL-7402/5-FU細胞活力，呈劑量和時間依賴性;倒置顯微鏡觀察發(fā)現不同濃度小柴胡湯均可以不同程度抑制細胞生長，且隨著濃度增高，其抑制程度也越強;集落形成實驗發(fā)現不同濃度小柴胡湯均能夠不同程度減少集落形成數量，影響細胞的生存能力;流式細胞儀檢測細

10、胞周期發(fā)現小柴胡湯能夠改變細胞周期分布，使BEL-7402/5-FU細胞阻滯于G2/M期;小柴胡湯下調CyclinG1的表達。(4)小柴胡湯誘導BEL-7402/5-FU細胞凋亡:熒光顯微鏡觀察發(fā)現小柴胡湯能夠誘導BEL-7402/5-FU細胞凋亡，不同濃度小柴胡湯濃度干預可使細胞密度減小，核高染（亮染）的細胞數增加;AnnexinⅤ-PI凋亡檢測結果顯示小柴胡湯誘導BEL-7402/5-FU細胞早期凋亡，且呈劑量依賴;小柴胡湯上調Ba

11、x表達，下調Bcl-2表達。(5)小柴胡湯抑制藥物泵的外排作用:小柴胡湯能夠顯著增加5-FU和ADM在BEL-7402/5-FU細胞內的蓄積;小柴胡湯增加BEL-7402/5-FU細胞內Rho123的蓄積;小柴胡湯顯著降低BEL-7402/5-FU細胞內ATP的含量;小柴胡湯能夠顯著下調多藥耐藥相關基因ABCB1、ABCC1及ABCG2的mRNA和蛋白表達。
　　2、動物實驗:(1)BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞

12、移植瘤的體積和重量檢測結果提示BEL-7402/5-FU細胞移植瘤較BEL-7402細胞移植瘤具有更明顯的耐藥性，而小柴胡湯能夠顯著抑制移植瘤生長，表明小柴胡湯可以降低BEL-7402/5-FU細胞移植瘤的化療耐藥;(2)TUNEL檢測細胞凋亡發(fā)現，與對照組比較，小柴胡湯和聯合給藥均可以顯著增加TUNEL的陽性細胞表達率，促進耐藥移植瘤組織的細胞凋亡，5-FU對TUNEL的陽性細胞表達率沒有明顯影響;(3)IHC檢測Ki-67表達結果發(fā)

13、現小柴胡湯能夠顯著增加Ki-67的陽性表達率，抑制耐藥移植瘤細胞增殖，而5-FU對耐藥移植瘤組織的細胞增殖未見明顯變化;(4)RT-PCR和Western-blot結果發(fā)現小柴胡湯能夠顯著下調Bcl-2、cyclinG1和轉運蛋白ABCB1、ABCC1、ABCG2的表達，上調Bax的表達;而5-FU對上述相關基因表達未見顯著影響。
　　3、靶點驗證:與BEL-7402細胞比較，BEL-7402/5-FU細胞倍增時間延長17.04

14、h，且具有更高的耐藥性;BEL-7402/5-FU細胞或移植瘤組織miR-122表達降低，與BEL-7402細胞或移植瘤比較，分別降低0.57倍和0.61倍，小柴胡湯增加耐藥細胞或移植瘤中miR-122的表達，分別升高2.36倍和2.82倍;BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞分別轉染inhibitors-miR-122或mimics-miR-122后，miR-122表達分別降低0.71倍或升高2056.98倍;BEL-74

15、02轉染inhibitors-miR-122后，對5-FU耐藥性沒有明顯改變，BEL-7402/5-FU細胞轉染mimics-miR-122，在0-1200μ M范圍內，增加BEL-7402/5-FU對5-FU的敏感性;BEL-7402/5-FU細胞轉染mimics-miR-122能夠抑制BEL-7402/5-FU細胞生長，增加其對5-FU的敏感性;miR-122能夠促進BEL-7402/5-FU細胞細胞凋亡;miR-122可以抑制BE

16、L-7402/5-FU細胞增殖;miR-122增加ADM和Rho123在BEL-7402/5-FU細胞內的蓄積;miR-122調節(jié)靶基因Bax、CDK4、CyclinG1和ABCB1的mRNA和蛋白表達。
　　結論:
　　1.體內外實驗結果表明小柴胡湯能夠逆轉肝癌多藥耐藥;
　　2.小柴胡湯逆轉肝癌多藥耐藥機制可能有以下幾個方面:
　　(1)小柴胡湯顯著抑制耐藥細胞BEL-7402/5-FU細胞增殖;