MDR1-P-gp與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎多藥耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主的慢性高致殘性自身免疫性疾病。其病理特征為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，以及由此導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞。目前RA的治療藥物主要包括:非甾體抗炎藥(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs)，緩解病情抗風(fēng)濕藥（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARD

2、s）以及近二十年來出現(xiàn)的生物制劑。臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)，雖然經(jīng)過正規(guī)早期聯(lián)合多種DMARDs藥物治療，仍有部分RA患者療效不佳;或者隨著治療時間的延長，藥物療效逐漸減弱，患者對治療藥物無反應(yīng)或低反應(yīng)。這些現(xiàn)象的發(fā)生被認為與多藥耐藥(Multiple DrugResistance，MDR)的形成有關(guān)。MDR現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)在腫瘤性疾病中，并且已經(jīng)有了較深入的認識。而它在RA等自身免疫性疾病中的研究才剛剛起步，其具體機制尚不明確。
　　目前國內(nèi)外

3、研究證實，MDR的一個重要機制是跨膜轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的藥物排出增加，導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度降低。而P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是其中最重要的一個轉(zhuǎn)運蛋白，它的作用底物非常廣泛，除了抗腫瘤藥物、抗生素類藥物之外，還包括多種DMARDs藥物。國外的研究和我們之前的研究顯示在耐藥的RA患者的滑膜組織和外周血淋巴細胞中P-gp的表達明顯增高，提示P-gp參與了RA的耐藥。而P-gp由多藥耐藥基因-1(Multidrug resi

4、stancegene-1，MDR-1)所編碼。我們猜測MDR1基因的突變或者其表達水平的改變可能會通過影響P-gp的表達及活性改變疾病對藥物的反應(yīng)性。因此，我們從MDR1基因入手研究其與RA中多藥耐藥的關(guān)系。
　　第一章:MDR1基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎多藥耐藥的相關(guān)性研究
　　目的:探討我國湖南地區(qū)漢族人群MDR1基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)多藥耐藥的相關(guān)性。
　　方法:

5、收集來自湖南地區(qū)204例使用兩種以上緩解病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)治療半年以上的RA患者以及104例正常對照的外周血，其中204例RA患者根據(jù)美國ACR20緩解標準將其分為兩組:112例治療有效組和92例耐藥組。利用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測兩組RA患者以及正常對照組MDR1基因G2677T/A和C1236T位點的多態(tài)性。

6、
　　結(jié)果:
　　1.G2677T/A和C1236T基因型及等位基因的分布頻率在正常人和RA治療有效組之間均無明顯差異(P＞0.05);
　　2.與RA治療有效組相比，RA耐藥組中攜帶2677TT基因型的患者較少(P=0.014);
　　3.C1236T基因型及等位基因的分布頻率在RA治療有效組及RA耐藥組中間無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在湖南地區(qū)漢族人群中，MDR1基因G267

7、7T/A和C1236T位點的多態(tài)性與RA易感性無明顯關(guān)聯(lián);
　　2.在湖南地區(qū)漢族人群中，耐藥的RA患者中攜帶MDR12677TT基因型的人數(shù)明顯少于治療有效的RA患者，提示2677TT基因型可能是RA治療中藥物耐藥的保護因素。
　　3.在湖南地區(qū)漢族人群中，MDR1基因C1236T位點的多態(tài)性與RA的多藥耐藥無明顯關(guān)聯(lián)。
　　第二章:MDR1基因高表達與RA多藥耐藥的相關(guān)性研究
　　目的:體外模擬高表達MDR1

8、的人RA滑膜耐藥細胞模型RA/MDR1，進一步深入探討MDR1介導(dǎo)的RA中多藥耐藥的分子機制。
　　方法:
　　1.體外利用重組腺病毒Ad-EGFP-MDR1感染人RA滑膜細胞，獲得RA/MDR1細胞。
　　2.利用Real-time PCR和Western blot法檢測RA/MDR1細胞MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平及其編碼產(chǎn)物P-gp蛋白的表達水平。
　　3.采用羅丹明123外排實驗驗證RA/MDR1細胞外排羅丹明1

9、23功能，MTT法檢測RA/MDR1細胞對甲氨蝶呤(MTX)的耐藥性。
　　結(jié)果:
　　1.RA滑膜細胞感染重組腺病毒Ad-EGFP-MDR172小時后，可見RA/MDR1細胞內(nèi)顆粒增加，細胞體積變大，生長速度變慢，熒光下可見明顯綠色熒光出現(xiàn)，感染率大于90％。
　　2.Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，相對于陰性病毒對照組細胞，RA/MDR1細胞MDR1的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平均有顯著

10、增加(p＜0.01; p＜0.05)。
　　3.RA/MDR1細胞外排羅丹明123能力較陰性病毒對照組細胞明顯增強(p＜0.01); MTX各個濃度對RA/MDR1細胞的抑制率均低于對陰性病毒對照組細胞(p＜0.05或p＜0.01)，且RA/MDR1細胞對MTX的耐藥性增加了37.36倍。
　　結(jié)論:體外成功模擬高表達MDR1的人RA滑膜耐藥細胞模型——RMMDR1;MDR1高表達可能通過上調(diào)P-gp的表達影響RA滑膜細胞對