豬A組輪狀病毒Vp7基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植物的研究.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus，RV)是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員，是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒及多種幼齡動物急性病毒性腹瀉的主要病原體之一。其感染廣泛，發(fā)病率也相當(dāng)高，5歲以下的嬰幼兒90﹪以上都感染過輪狀病毒。目前還沒有治療輪狀病毒腹瀉的特效藥物。接種疫苗來預(yù)防輪狀病毒感染顯得尤為重要。另外流行病學(xué)的研究表明自然感染RV后，可以使人和動物產(chǎn)生自然免疫力。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展和植物細(xì)胞培養(yǎng)及再生方法的完善，有研究表明，將細(xì)菌性和病毒

2、性病原體抗原的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，能夠表達(dá)出較好保留天然免疫原性的抗原，因此科學(xué)研究者們嘗試將轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愃璋嘿F藥品的廉價的“生產(chǎn)工廠”。 隨著研究的深入，現(xiàn)已明確了輪狀病毒的基因結(jié)構(gòu)。其病毒粒子由三層衣殼組成，其中外殼由VP7和VP4兩個蛋白組成。VP7是一種糖蛋白，是構(gòu)成外殼蛋白的主要成分。它不僅是病毒的中和蛋白而且能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，因此對其進(jìn)行克隆和分析在疫苗的研制中具有重要的意義?；诖嘶A(chǔ)之上本

3、實(shí)驗(yàn)將輪狀病毒主要抗原基因VP7轉(zhuǎn)化于煙草之中，從而為進(jìn)一步生產(chǎn)輪狀病毒植物疫苗奠定基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了以下三個方面的研究：(1)植物表達(dá)載體的構(gòu)建：以pBI121載體為背景，根據(jù)已克隆的Vp7基因序列設(shè)計(jì)了一對引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增、BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切后與pBI121載體連接，構(gòu)建成植物高效表達(dá)載體pBI121-Vp7，通過卡那霉素篩選獲得陽性克隆，測序比較后通過凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中備侵染用。 (2

4、)轉(zhuǎn)基因煙草的研究：通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將Vp7基因轉(zhuǎn)化入煙草NC89中。經(jīng)過卡那霉素抗性篩選最終獲得了轉(zhuǎn)基因煙草50株。通過提取轉(zhuǎn)基因煙草的DNA、RNA分別進(jìn)行PCR、RT-PCR檢測；然后提取植株的總蛋白，通過SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)了重組抗原蛋白，隨后進(jìn)行了Western雜交檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的重組抗原具有反應(yīng)原性。 (3)苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，選取子葉和下胚軸為外植體，采