農(nóng)桿病毒法轉(zhuǎn)基因植物疫苗的初步研究.pdf

1、煙草壞死病毒A(TobacconecrosisvirusA，TNV-A)是單鏈RNA病毒，它的全基因組序列已被測出，含有6個開放表達閱讀框。本研究利用套疊PCR的方法將克隆于pMD18-T載體上煙草壞死病毒A(TNV-A)基因的ORFⅣ與ORFⅤ(外殼蛋白)之間的非編碼區(qū)形成突變SphI位點，構(gòu)建了7個中間載體：pBSac-1、pMD18-TNV-1、pBSac-2、pMD18-TNV-S、pUCm-GFP、pUCm-LTB、pBluS

2、KP-TNV-S。 將綠色熒光蛋白基因(GFP)、不耐熱性腸毒素B亞單位(LTB)基因插入SphI突變位點，最后將突變后并連有GFP、LTB目的基因以及只含有突變的SphI酶切位點但未連有任何目的基因的TNV-A全基因插入植物表達載體pE1802的SalI/SmaI之間，構(gòu)建成植物病毒載體pE-TNV-GFP、pE-TNV-LTB、pE-TNV。將這三種病毒載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，構(gòu)建了農(nóng)桿菌工程菌。 使用2ml沒

3、有針頭的注射器將這三種農(nóng)桿菌懸浮液壓力滲透至心葉煙植株的葉片。每株注射約100μL的懸浮菌液，2周左右接種部位有可見枯斑，但未接種部位的葉片未見有枯斑。提取帶有的枯斑心葉煙葉片總RNA，進行RT-PCR證實這三種病毒載體可以在心葉煙植株中局部表達。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，通過抗性篩選，獲得三種生長狀況良好的轉(zhuǎn)基因煙草植株，進一步通過PCR、RT-PCR證實三種病毒基因已經(jīng)在煙草中表達。 本研究利用實驗室保存的農(nóng)