草魚呼腸孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表達及VP5、VP7蛋白亞細胞定位研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)為雙鏈分段RNA病毒,隸屬于呼腸孤病毒科水生呼腸孤病毒屬,是引起草魚出血病的主要病原,主要危害草魚魚種并引起草魚出血病,嚴重影響我國淡水漁業(yè)的發(fā)展。本研究從患出血病的草魚中分離草魚呼腸孤病毒將其命名為GCRV096。提取病毒基因組RNA,運用同源序列擴增法獲得vp5與vp7基因cDNA全長,并對其進行表達,而且研究了VP5、VP7蛋白的亞細胞定位。
　　 vp5基

2、因cDNA全長為1981bp,ORF為1947bp,編碼648個氨基酸,預測分子量為68.65 kDa,理論等電點為6.13。GCRV096VP5氨基酸序列與金體美洲鳊魚呼腸孤病毒(GSRV)VP4氨基酸序列、草魚出血病病毒(GCHV)VP5氨基酸序列同源性較高,達90％以上。構建了vp5原核表達載體pET-VP5,在大腸桿菌BL21中成功誘導表達；重組蛋白主要以包涵體形式存在,通過His TrapTM HP柱子純化重組蛋白;Weste

3、rnblot分析結(jié)果表明所表達的蛋白為目的蛋白。構建了vp5基因的真核表達載體pEGFP-VP5,采用脂質(zhì)體介導將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIK細胞,轉(zhuǎn)染24h后在熒光顯微鏡中觀察到VP5重組蛋白能在CIK細胞中瞬時表達,VP5重組蛋白在整個CIK細胞中都有分布,但主要分布在細胞核中。
　　 vp7基因cDNA全長為852bp,ORF為831bp,編碼276個氨基酸,預測分子量約為29.85kDa理論等電點為6.31。GCRV096VP7氨

4、基酸序列與溝鯰魚呼腸孤病毒(CCRV)VP7氨基酸序列同源性最高,達100％。構建了vp7原核表達載體pET-VP7,在大腸桿菌BL21中成功誘導表達；重組蛋白主要以包涵體形式存在,通過His TrapTM HP柱子純化重組蛋白；Westernblot分析結(jié)果表明所表達的蛋白為目的蛋白。構建了vp7基因的真核表達載體pEGFP-VP7采用脂質(zhì)體介導將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIK細胞,轉(zhuǎn)染24h后在熒光顯微鏡中觀察到VP7重組蛋白分布在整個CIK細

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