豬A組輪狀病毒Vp7基因工程乳酸菌的制備及其免疫效果的檢測(cè).pdf

1、輪狀病毒(Rotavinls，RV)是引起嬰幼兒和各種幼齡動(dòng)物非細(xì)菌性腹瀉的主要病原之一。由于目前尚無(wú)治療輪狀病毒的特效藥物，因此預(yù)防顯得尤為重要。為此，世界衛(wèi)生組織多次呼吁各國(guó)科學(xué)家研制開(kāi)發(fā)有效的輪狀病毒疫苗，并將其列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項(xiàng)目之一。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，現(xiàn)已明確VP7是RV的主要外殼蛋白和保護(hù)性抗原之一，在疫苗的研制中具有重要的意義。 本實(shí)驗(yàn)選擇乳酸菌作為受體菌株表達(dá)外源基因Vp7，即可將乳酸菌的益生功能

2、和外源基因的特異性免疫相結(jié)合，從而研制豬輪狀病毒Vp7基因工程乳酸菌。目的在于為開(kāi)發(fā)研制預(yù)防豬輪狀病毒病的基因工程乳酸菌口服疫苗奠定實(shí)踐基礎(chǔ)。 在本研究中，將豬A組輪狀病毒主要保護(hù)性抗原Vp7克隆至可在大腸桿菌和乳酸菌中穿梭表達(dá)的具有紅霉素和胸苷酸基因的雙標(biāo)記表達(dá)載體。經(jīng)過(guò)優(yōu)化電轉(zhuǎn)化條件，將重組質(zhì)粒pW425et-Vp7轉(zhuǎn)化到乳酸菌受體菌中，通過(guò)乳酸菌質(zhì)粒的提取，酶切分析和PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆質(zhì)粒。將篩選好的陽(yáng)性克隆進(jìn)行SDS

3、-PAGE及Western bloting檢測(cè)，結(jié)果表明外源基因Vp7在乳酸菌中獲得了表達(dá)。將可以表達(dá)的重組pW425et-Vp7基因工程乳酸菌給4～5周齡的BALB/c小鼠連續(xù)灌服，免疫期30天。分別在第5、10、15、20、25、30d灌服1h后，摘除眼球采集血清及腸道內(nèi)容物，采用間接ELISA 方法檢測(cè)血清抗體和SIgA的水平。另外，免疫后每隔10天，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>T細(xì)胞和CD19