豬輪狀病毒NSP4基因原核與真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)研究.pdf

1、輪狀病毒(rotavirusRV)是仔豬腹瀉的重要原因，仔豬感染RV后迅速發(fā)生腹瀉，嚴(yán)重者常因脫水而死亡，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害。RV血清型眾多，血清的免疫交叉保護(hù)性低，研究新型疫苗已經(jīng)成為防制RV腹瀉的研究熱點(diǎn)。最近的研究顯示輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4與RV免疫相關(guān)，有可能成為輪狀病毒疫苗研制的候選基因。本研究則從豬輪狀病毒NSP4著手對(duì)其特性進(jìn)行初步研究，主要內(nèi)容如下： 1.豬輪狀病毒NSP4基因的克隆及鑒定 根據(jù)基

2、因庫(kù)中已發(fā)表的豬輪狀病毒OSU株NSP4基因設(shè)計(jì)含XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)的上、下游引物，并利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從病毒基因組中獲得NSP4基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)547bp，構(gòu)建了克隆載體pMD-19T-NSP4。序列分析顯示，經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的OSU株產(chǎn)生了很大的變異，它與報(bào)道的OSU株核苷酸序列同源性為81％，氨基酸同源性為83％，主要變異區(qū)段集中在C末端。該毒株更趨向于人輪狀病毒，它與人輪狀病毒G10株核苷酸

3、同源性為93％，與氨基酸序列同源性為95％。 2.NSP4基因片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)研究 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物擴(kuò)增了去掉前端疏水區(qū)的300bp左右的NSP4基因片段，并將其克隆入pMD-19Tsemple載體。然后通過(guò)XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到pet32a(+)載體上獲得能表達(dá)NSP4蛋白C端片段(86-174aa)的原核表達(dá)載體pet32a-NSP4c。利用原核表達(dá)并純化的NSP4c蛋白和免疫小鼠獲得的陽(yáng)

4、性抗體構(gòu)建了檢測(cè)NSP4抗體的間接ELISA方法。 3.NSP4基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)研究 將NSP4基因片段通過(guò)XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到pEGFP-N1載體上構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NSP4。隨后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pEGFP-N1-NSP4轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞。該載體含有綠色熒光蛋白，因此直接用熒光倒置顯微鏡檢測(cè)了NSP4基因的表達(dá)情況。將昆明小鼠分成隨機(jī)3組。第一、二組為空白對(duì)照和空載體

5、對(duì)照，分別注射生理鹽水(100μl/只)，pEGFP-N1(100μg/只)。第三組為實(shí)驗(yàn)組，注射pEGFP-N1-NSP4(100μg/只)。每?jī)芍苊庖咭淮?，共免疫三次。分別在免疫的第0d、14d、21d、28d、35d和42d采血制備血清，用ELISA檢測(cè)抗體水平。第21d即可檢測(cè)出抗NSP4陽(yáng)性抗體，第28d、35d陽(yáng)性抗體水平增加，第42d抗體水平下降。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-NSP4進(jìn)行動(dòng)物免