豬A組輪狀病毒VP6基因轉(zhuǎn)植物的研究.pdf

1、豬輪狀病毒病(Porcine rotavims disease)是由輪狀病毒(Rotavirus，RV)引起的仔豬急性胃腸道傳染病。其臨床癥狀為：發(fā)燒、嘔吐、惡心、腹瀉、嚴(yán)重時可導(dǎo)致幼畜脫水，成年豬一般呈隱性感染。除感染豬外，還可感染人及牛、羊等動物。輪狀病毒病發(fā)病日齡小、發(fā)病急以及死亡率高。沒有特異性藥物，只能以預(yù)防為主。在我國，豬輪狀病毒分布廣泛，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，對豬輪狀病毒進行有效的防治是降低仔豬發(fā)病率，提高養(yǎng)豬

2、業(yè)效益的有效手段。1992年Mason提出“轉(zhuǎn)基因植物疫苗”利用分子生物學(xué)技術(shù)把外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞中，在植物中能夠大量表達外源基因的一種生物技術(shù)。 VP6蛋白是輪狀病毒第六個基因編碼的內(nèi)殼蛋白，而且也是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，約占病毒蛋白的50％。其具有較高的免疫原性和抗原性，它在檢測病毒粒子的診斷方法中是最主要地靶蛋白。雖然抗VP6抗體沒有中和抗體反應(yīng)，可是Esquivel FR et al報道VP6蛋白能增強中和抗體應(yīng)答反應(yīng)。隨

3、后Feng N et al研究人員認(rèn)為中和抗體反應(yīng)的水平并不是總與保護關(guān)聯(lián)。由VP6蛋白產(chǎn)生的非中和IgA單克隆抗體在活體內(nèi)起到免疫作用，以抵抗輪狀病毒的感染，而不是輪狀病毒特異的血清IgG。 依據(jù)上述思路，根據(jù)VP6基因序列和原核表達載體pET5a序列，合成了一對特異性引物RO1/RO2，分別引入限制性酶切位點NdeⅠ和BamHI。以RO1/RO2為引物，以pGEM-T-Easy-VP6為模板，經(jīng)PCR擴增得到1.194kb的

4、VP6基因片段。以BamHI和NdeⅠ雙酶切VP6基因片段，與經(jīng)同樣雙酶切的pET5a原核表達載體線性分子相連接，轉(zhuǎn)化到EColi BL21(DE<,3>)Plyss中，然后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，結(jié)果表明已成功表達了VP6蛋白，而且獲得了大小為44KD的蛋白。 然后再根據(jù)VP6基因序列和植物表達載體pBI121序列，合成了一對特異性引物RO3/RO4，分別引入限制性酶切位點BamHI和SacⅠ。以RO3/RO4為引物，以pGEM-

5、T-Easy-VF6為模板，經(jīng)PCR擴增得到1.194kb的VP6基因片段。以BamHI和SacⅠ雙酶切VP6基因片段，與經(jīng)同樣雙酶切的pBI121植物表達載體線性分子相連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a中，然后經(jīng)卡那抗性篩選的陽性菌落送去測序，最后結(jié)果表明已成功的構(gòu)建了植物表達載體pBI121-VP6。 以凍融法將pBI121-VP6重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，用葉盤法轉(zhuǎn)化于NC89煙草和保定紫花苜蓿的無菌試管苗。經(jīng)

6、過愈傷誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)，最后分化出再生苗，并經(jīng)過卡那霉素(Kan)抗性篩選，獲得了80株轉(zhuǎn)基因NC89煙草的卡那抗性再生植株；可是沒有保定紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因苗。經(jīng)卡那抗性篩選的轉(zhuǎn)基因煙草再生苗，提取植物總DNA和RNA，分別經(jīng)過PCR、RT-PCR擴增，然后以PCR-Southern，Dot-blotting雜交檢測，這些結(jié)果表明VP6基因已經(jīng)成功的整合到轉(zhuǎn)基因Nc89煙草染色體上并正確的轉(zhuǎn)錄。 經(jīng)檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因再生苗，提