Ang-1或-和VEGF165轉(zhuǎn)基因細胞修飾的再生絲素膜誘導血管形成效應(yīng)及分子機制研究.pdf

1、目的：研究腺病毒介導的人血管生成素-1(Ad-Ang-1)或/和血管內(nèi)皮生長因子165(Ad-VEGF165)轉(zhuǎn)基因細胞修飾的再生絲素膜誘導血管形成活性及其分子機制。 方法：以pcDNA3.0-VEGF165質(zhì)粒為模板PCR擴增人VEGF165基因片段，同時抽取人骨髓細胞總RNA，經(jīng)RT-PCR克隆出人Ang-1基因片段，分別將其亞克隆至本室改建的pAdTrack-CMV-IRES重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中經(jīng)PCR、雙酶切和DNA測序鑒定后

2、，將上述構(gòu)建正確的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用Pme I酶切線性化后分別與pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183大腸桿菌中進行同源重組，得到的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切后再用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染QBI-293A人胚腎成纖維細胞(293A)，經(jīng)多輪感染和擴增后獲得Ad-IRES空載體腺病毒、Ad-VEGF165單基因重組腺病毒、Ad-Ang-1單基因重組腺病毒和Ad-Ang-1-VEGF165雙基因共表達重組腺病毒，經(jīng)效價測定后分別感染在絲素膜等

3、不同材料上培養(yǎng)的293A細胞，觀察其形態(tài)學改變并用EIASA法檢測目的基因的表達。同時開展下列功能實驗：(1)ELISA法檢測Ang-1或/和VEGF165單、雙基因重組腺病毒對WI-38人胚肺成纖維細胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF2)、血小板衍化生長因子(PDGF)表達的影響；基因芯片法檢測再生絲素膜對Ad-Ang-1-VEGF165雙基因共表達重組腺病毒修飾的WI-38細

4、胞基因表達譜的影響。(2)將Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因WI-38細胞修飾的絲素材料進行雞胚尿囊膜血管形成實驗(CAM)。(3)建立大鼠背部皮膚全層切割傷模型，按下列4組：再生絲素膜(SF)組、再生絲素膜+MSC細胞(SFMSC)組、再生絲素膜+MSC細胞+Ad-Ang-1-VEGF(SFMSCAV)組及空白對照(PBS)組開展了組織損傷修復(fù)試驗，通過創(chuàng)傷組織大體觀察和病理組織學檢測來研究Ad-Ang-1-VEGF165轉(zhuǎn)基因細

5、胞修飾的再生絲素膜對皮膚創(chuàng)傷的治療作用。 結(jié)果：以pcDNA3.0-VEGF165質(zhì)粒和人骨髓細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板PCR分別擴增出576bp的人VEGF165和1497bp的人Ang-1目的基因片段，亞克隆的VEGF165和Ang-1基因片段的序列測定結(jié)果與GenBank報道的完全一致，成功構(gòu)建了pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165、pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES和pAdTrack

6、-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165重組質(zhì)粒，并成功獲得了Ad-VEGF165、Ad-Ang-1單基因腺病毒載體和Ad-Ang-1-VEGF165雙基因共表達重組腺病毒載體。ELISA法證實上述各組腺病毒載體均能在再生絲素膜上生長的293A細胞中成功表達目的基因Ang-1、VEGF。同時，再生絲素膜對Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因的WI-38成纖維細胞不僅有利于與血管形成相關(guān)的Ang-1或/和VEGF目的基因的高表達，而

7、且也有利于WI-38細胞自身分泌的與組織損傷修復(fù)相關(guān)的FGF-2、PDGF的穩(wěn)定表達?；蛐酒Y(jié)果表明再生絲素膜不僅有利于WI-38成纖維細胞黏附、生長相關(guān)基因的表達，而且對Ad-Ang-1-VEGF165雙基因共表達腺病毒載體轉(zhuǎn)基因WI-38細胞又可增強其血管形成和組織修復(fù)相關(guān)基因的表達。CAM實驗表明Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因WI-38細胞修飾的再生絲素膜具有促進CAM上血管生成的活性，并通過大鼠創(chuàng)傷修復(fù)實驗進一步證明Ad

8、-Ang-1-VEGF165轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細胞修飾的絲素材料還可促進創(chuàng)傷組織的血管生成，從而有利于其恢復(fù)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了腺病毒介導的Ang-1或/和VEGF165基因表達載體，再生絲素膜不僅利于與血管形成有關(guān)的目的基因Ang-1、VEGF在成纖維細胞中呈現(xiàn)高效表達，而且也能維持或促進成纖維細胞自身分泌的與血管新生和組織損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達。通過Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因細胞修飾后的再生絲素膜具有誘導血管生成的活性