Ang-1或-和VEGF165轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的再生絲素膜誘導(dǎo)血管形成效應(yīng)及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究腺病毒介導(dǎo)的人血管生成素-1(Ad-Ang-1)或/和血管內(nèi)皮生長因子165(Ad-VEGF165)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的再生絲素膜誘導(dǎo)血管形成活性及其分子機(jī)制。 方法：以pcDNA3.0-VEGF165質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增人VEGF165基因片段，同時抽取人骨髓細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT-PCR克隆出人Ang-1基因片段，分別將其亞克隆至本室改建的pAdTrack-CMV-IRES重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中經(jīng)PCR、雙酶切和DNA測序鑒定后

2、，將上述構(gòu)建正確的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用Pme I酶切線性化后分別與pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，得到的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切后再用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染QBI-293A人胚腎成纖維細(xì)胞(293A)，經(jīng)多輪感染和擴(kuò)增后獲得Ad-IRES空載體腺病毒、Ad-VEGF165單基因重組腺病毒、Ad-Ang-1單基因重組腺病毒和Ad-Ang-1-VEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒，經(jīng)效價測定后分別感染在絲素膜等

3、不同材料上培養(yǎng)的293A細(xì)胞，觀察其形態(tài)學(xué)改變并用EIASA法檢測目的基因的表達(dá)。同時開展下列功能實(shí)驗(yàn)：(1)ELISA法檢測Ang-1或/和VEGF165單、雙基因重組腺病毒對WI-38人胚肺成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF2)、血小板衍化生長因子(PDGF)表達(dá)的影響；基因芯片法檢測再生絲素膜對Ad-Ang-1-VEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒修飾的WI-38細(xì)

4、胞基因表達(dá)譜的影響。(2)將Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因WI-38細(xì)胞修飾的絲素材料進(jìn)行雞胚尿囊膜血管形成實(shí)驗(yàn)(CAM)。(3)建立大鼠背部皮膚全層切割傷模型，按下列4組：再生絲素膜(SF)組、再生絲素膜+MSC細(xì)胞(SFMSC)組、再生絲素膜+MSC細(xì)胞+Ad-Ang-1-VEGF(SFMSCAV)組及空白對照(PBS)組開展了組織損傷修復(fù)試驗(yàn)，通過創(chuàng)傷組織大體觀察和病理組織學(xué)檢測來研究Ad-Ang-1-VEGF165轉(zhuǎn)基因細(xì)

5、胞修飾的再生絲素膜對皮膚創(chuàng)傷的治療作用。 結(jié)果：以pcDNA3.0-VEGF165質(zhì)粒和人骨髓細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板PCR分別擴(kuò)增出576bp的人VEGF165和1497bp的人Ang-1目的基因片段，亞克隆的VEGF165和Ang-1基因片段的序列測定結(jié)果與GenBank報道的完全一致，成功構(gòu)建了pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165、pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES和pAdTrack

6、-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165重組質(zhì)粒，并成功獲得了Ad-VEGF165、Ad-Ang-1單基因腺病毒載體和Ad-Ang-1-VEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體。ELISA法證實(shí)上述各組腺病毒載體均能在再生絲素膜上生長的293A細(xì)胞中成功表達(dá)目的基因Ang-1、VEGF。同時，再生絲素膜對Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因的WI-38成纖維細(xì)胞不僅有利于與血管形成相關(guān)的Ang-1或/和VEGF目的基因的高表達(dá)，而

7、且也有利于WI-38細(xì)胞自身分泌的與組織損傷修復(fù)相關(guān)的FGF-2、PDGF的穩(wěn)定表達(dá)。基因芯片結(jié)果表明再生絲素膜不僅有利于WI-38成纖維細(xì)胞黏附、生長相關(guān)基因的表達(dá)，而且對Ad-Ang-1-VEGF165雙基因共表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)基因WI-38細(xì)胞又可增強(qiáng)其血管形成和組織修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)。CAM實(shí)驗(yàn)表明Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因WI-38細(xì)胞修飾的再生絲素膜具有促進(jìn)CAM上血管生成的活性，并通過大鼠創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Ad

8、-Ang-1-VEGF165轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素材料還可促進(jìn)創(chuàng)傷組織的血管生成，從而有利于其恢復(fù)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了腺病毒介導(dǎo)的Ang-1或/和VEGF165基因表達(dá)載體，再生絲素膜不僅利于與血管形成有關(guān)的目的基因Ang-1、VEGF在成纖維細(xì)胞中呈現(xiàn)高效表達(dá)，而且也能維持或促進(jìn)成纖維細(xì)胞自身分泌的與血管新生和組織損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)。通過Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾后的再生絲素膜具有誘導(dǎo)血管生成的活性